[发明专利]一种红法夫酵母菌中虾青素分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及虾青素，尤其是涉及一种红法夫酵母菌中虾青素分离纯化的方法。 

背景技术

虾青素，学名为3,3’-二羟基-β,β’-胡萝卜素-4,4’-二酮，分子式C₄₀H₅₂O₄，相对分子质量596.86，是一种非维生素A原的类胡萝卜素、萜烯类不饱和化合物，其结构式如下所示： 

虾青素呈艳丽的红色，具有极强的色素沉积能力(Shoji Y,Yoshito T,Muneo S,et al.Aquaculture,1990,87(3):323-330.)；虾青素是一类断链抗氧化剂，能向自由基提供电子或与自由基进行反应，吸收自由基多余的能量，使之变为非活性的或较稳定的化合物，中断自由基的氧化反应过程，具有较强的抗氧化性能(Kurashige M,Okimasu E,Inoue M,et al.Physiol.Chem.Phys.Med.NMR.,1990,22:27-38.)；同时，虾青素能明显增强机体局部和全身的免疫能力，抵抗机体炎症，免疫调节特性与抗氧化性相结合，在防止疾病的发生与传播中发挥重要作用(Jyonouchi H,Gross M,Tomita Y.Nutr.Cancer.,1994,21:47-58.)；虾青素对癌细胞增殖有较强的抑制作用，高浓度的虾青素能杀伤肿瘤细胞，降低某些致癌物诱导的癌症发生率(Roger et al.Biotechnology Bioengineering,2010,9(20):245-257.)。 

目前，虾青素已成为国内外研究的热点。虾青素的独特性质使它具有较高的应用价值，其在食品添加剂、化妆品、保健品、水产养殖和医药等诸多领域具有很大的潜力，开发应用前景广阔，发达国家需求量日益增加。许多公司生产的虾青素产品安全性已经得到了美国FDA的GRAS认证、欧盟新资源食品认证、清真犹太Kosher认证、中国卫生部新资源食品认证。 目前生产雨生红球藻来源天然虾青素的有5个国家的7家公司：美国Cyanotech公司(占据了全球食品级虾青素市场份额的70％以上)、日本FUJI化学集团(控制瑞典、夏威夷两家工厂)、YAMAHA集团、Biogenic公司、中国荆州市天然虾青素有限公司、印度Bioprex公司、以色列Algatech公司，我国厦门汇盛生物科技有限公司有生产小批量红发夫来源的天然虾青素。 

天然虾青素一般有如下来源：虾壳等水产品加工废弃物、雨生红球藻等藻类、乳酸分支杆菌等细菌、红法夫酵母。以甲壳加工的下脚料为原料提取虾青素是生产的主要途径之一，国内外在这方面均有大量的研究，且主要采用以下三种提取方法：碱提法、有机溶剂萃取法和超临界CO₂萃取法。其中，关于天然虾青素分离纯化的专利报道主要有：中国专利101691348从雨生红球藻中超临界提取虾青素的方法，利用超临界CO₂萃取工艺提取虾青素。中国专利102106448A将虾蟹壳烘干后，用醋酸浸取、用蛋白酶除去蛋白质、乙醇溶解、盐酸沉降得到质量分数为5-15％的虾青素。中国专利1534020将酵母与提取溶媒按比例混合后进行负压空化混旋固液萃取，减压浓缩后，再经负压柱层析和正压柱层析纯化得98％成品。中国专利1548420将红法夫酵母湿菌体与含抗氧化剂的有机酸或酸性有机溶剂搅拌混合提取虾青素，从酵母泥到虾青素浓缩液的总提取收率达到80％以上。中国专利CN1534020在加热和搅拌的条件下采用低浓度乙醇溶液在加热条件下滤除去对鱼水溶性化合物，再用二氯甲烷与已烷组成的混合溶剂进行萃取，经蒸馏后得到含虾青素约7％左右的虾青素浸膏产品。这些专利提到的技术，有的因为高压、减压、低温技术而大大增加分离纯化的成本，有些因为采用酸热、使用易残留有机溶剂而降低了虾青素的活性。本申请人在中国专利CN101838614A中公开一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用，涉及一种微生物菌株及其获取方法。所述一种虾青素生产菌株为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变菌株N1806-04。以红法夫酵母为出发菌株，采用酶法制备红法夫酵母原生质体，再通过NTG诱变及β-紫罗酮筛选等方法进行虾青素生产菌株的选育，获得虾青素生产菌株，连续传代5次后虾青素的产量稳定。将该虾青素生产菌株用发酵罐放大培养，其虾青素产量和含量分别可达500～600mg/L和5000～6300mg/kg(细胞干重)，生物量可达80～110g/L。虾青素产量和含量以及对应的生物量都满足了工业化生产的要求，具有很大的应用前景。