[发明专利]一种用于检测醋酸格拉替雷样本的UPLC方法

说明书

本发明提供一组与醋酸格拉替雷(共聚物‑1)结构相似的内标肽作为共聚物‑1分子量测定用内标以及与其配套使用的UPLC检测及分离参数，使用方法能够在高分辨的UPLC分离技术下，更准确的测定目标聚合物的分子量及分子量分布。

技术领域

本发明涉及一种用于检测醋酸格拉替雷样本的超高效液相色谱色谱(UltraPerformance Liquid Chromatography，UPLC)方法及与其配套使用的内标肽组。

背景技术

自身免疫类疾病(autoimmune diseases)是指，生物机体的免疫系统将一些机体本身的组织当作“外来物”进行攻击的现象。通常这种疾病可以通过阻碍生物机体T细胞和B细胞对机体自身组织的反应，得到缓解。这些早期的免疫反应是通过抗原结合到MHC分子上促进的，并通过T细胞表达出来。自身免疫类疾病就是机体本身的组织和蛋白质被当作“自抗原”，被机体免疫系统攻击。例如：多发性硬化症，就是免疫系统对隔离和保护神经的髓鞘进行攻击而导致的疾病，这种疾病发展到失去髓鞘，就会带来神经元和运动神经功能丧失；其他例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自免疫性溶血性贫血等，也属于此类疾病。

很多药物开发出来用于治疗自身免疫类疾病，包括多发性硬化症。醋酸格拉替雷(又叫共聚物-1)是由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸通过聚合产生的不同分子量聚合物的混合物。它的四种氨基酸摩尔比大约是0.392～0.462:0.129～0.153:0.300～0.374:0.086～0.100(Ala：Glu：Lys：Tyr)，混合物中的共聚物的平均分子量大约5000～9000道尔顿。

为了能够确保得到的共聚物-1具有药效，就必须准确的知道多氨基酸混合物在合成过程中的平均分子量分布和变化，例如用Superose12色谱柱进行分析确定分子量，但是，由于对于不确定含量及分子量的聚合物混合物而言，由于没有标准对照物，因此，进行分子量检测时，多使用内标法进行评价，此时，质量合乎标准的内标物质对于检测结果的准确性至关重要。

对于共聚物-1的内标物，上世纪末，US6514938记载了使用合成的多肽作为内标物调整色谱柱的校正系数，能够较为准确测量共聚物-1平均分子量。但是，随着分离技术的不断发展，尤其是如高分辨的UPLC色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，超高效液相色谱)技术的不断成熟，该方法专属性不强的缺点就被暴露出来，在如UPLC的相对严格的条件下，需要对该方法进行修正，从而更准确的检测目标聚合物的分子量及分子量分布，以便为相关的药物质量控制提供更为准确的参考。

发明内容

本发明提供一组与目标化合物(共聚物-1)结构相似的内标肽作为共聚物-1分子量测定用内标以及与其配套使用的UPLC检测及分离参数，使用该内标能够在高分辨的UPLC分离技术时，更准确的测定目标聚合物的分子量及分子量分布。为相关研究提供更为真实的数据支持。

本发明首先涉及一种用来检测共聚物-1的UPLC方法，该方法使用BEH125SEC色谱柱与BEH200SEC两根色谱柱任意串联的UPLC系统，柱参数为1.7um，4.6×150mm；使用pH值3.0-5.0(优选为3.5)、浓度0.1-0.5mol/l(优选为0.25)的甲酸铵或乙酸铵作为缓冲液；将所述缓冲液与乙腈按照缓冲液：乙腈＝1:9配制流动相；所述流动相通过过滤法除菌除杂。

本发明所述的UPLC方法中，绘制内标肽校准曲线和检测目标共聚物-1时的方法参数还包括，本发明所述的串联色谱柱系统的进样和检测样本时，柱温控制在30-60℃，优选为50℃；根据所述的串联系统，制备标准曲线时内标肽组的进样量为1-20ul，样品浓度0.01～0.1mg/ml，优选为0.05mg/ml；根据所述的串联系统，检测目标共聚物-1时，样品的浓度为0.1-10mg/ml，优选为4mg/ml。

本发明所述的UPLC方法中，所使用的内标肽组合共包含7条内标肽，所述的内标肽序列见表1