[发明专利]一种利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物饲料和生物工程的技术领域，具体涉及一种利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法。 

背景技术

花生粕是花生仁经压榨提炼油料后的副产品，含丰富的植物蛋白。花生粕的营养价值较高，其代谢能是粕类中最高的，粗蛋白质含量达48%以上，是我国重要的植物来源蛋白饲料，我国每年花生粕资源约在300多万吨左右。然而，由于花生粕的蛋白品质和其他植物蛋白一样，都以大分子结构存在，且存在抗营养因子，阻碍蛋白的消化、吸收，蛋白的利用率相对偏低。 

然而，目前对花生粕的开发利用还相对较少，要获得高含量（绝对量高于25%）的多肽都是通过液体酶解的方法进行，产品得率较低，干燥成本过高，且由于产品应用面较窄，替代原料丰富，难以实现在花生粕上的规模化生产。最近，固态发酵由于含水量少，基本不产生废弃物，环境污染少，容易处理等优点，被研究人员应用与花生粕的高值化中。目前，采用芽孢杆菌和乳酸菌共同发酵产生发酵花生粕，作为饲料原料得到了较大的关注。然而，由于芽孢杆菌产生中性蛋白酶，在乳酸菌共同发酵下，发酵体系快速变为酸性，芽孢杆菌及中性蛋白酶难以发挥作用，且芽孢杆菌和乳酸菌分别为好氧微生物和厌氧微生物，两者对氧的需求不一致，微生物生长有限（产品乳酸菌10⁸CFU/g），也导致产品的有益代谢产物含量有限，如多肽含量在8%左右，乳酸含量3%左右。 

为解决花生粕饲用品质的缺陷，结合目前饲料领域常用的多肽产品、益生菌、益生素和酶制剂，通过生物技术处理过程，将这些有益添加剂的功能集于一身，制备了益生肽。首先，发酵过程可以看作营养物质在体外的预消化过程，花生粕中抗营养因子被分解去除，大分子蛋白质被分解成多肽和部分小肽，肽的吸收具有转运速度快、耗能低、载体不易饱和等优点且各种肽之间转运无竞争性与抑制性，动物组织还可以直接利用肽中的氨基酸合成组织蛋白，减少能量消耗；其次，幼龄动物胃肠道生理及微生物区系发育还未健全，胃分泌盐酸能力较差，盐酸缺乏后造成胃中pH值升高而抑制胃蛋白酶活性而且随着在饲料中的添加，使得营养物质的消化率较低，发酵过程积累的外源消化酶和有益代谢物的大量补充，有助于改善肠道微生物区系平衡，增强动物机体免疫力，显著提高营养物质在动物体内的消化利用效率。同时，由于食品安全越来越受到关注，欧盟已在2006年全面禁止在饲料中添加抗生素，寻找抗生素替代品的工作也已取得一定的进展。研究发现，在饲料中添加益生菌（乳酸菌）或其代谢产物乳酸能有效改善动物肠胃的微生物环境，有效防止消化道疾病，激发机体免疫功能，提高机体抗病、抗应激能力，提高饲料的利用率和动物生产性能。 

因此，在目前动物营养理论体系的基础上，针对目前存在技术的不足，通过好氧微生物和厌氧微生物两步发酵，实现花生粕蛋白的体外降解，积累有益的代谢产物多肽和消化酶，同时富集大量的益生菌，制备益生肽，对提高饲料的利用率和动物生产性能，缓解抗生素滥用具有重要的作用，对饲料工业和养殖业的健康持续发展具有变革性的意义。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是利用花生粕二步固态发酵生产益生肽，益生肽的多肽含量达到25%以上，乳酸含量达到8.0%以上，乳酸菌活菌数达到10⁹ CFU/g以上，酸性蛋白酶达到200U/g以上。二步固态发酵分别为好氧发酵和厌氧发酵，所采用微生物符合《饲料添加剂品种目录（2013）》，分别为高产酸性蛋白酶的黑曲霉（CGMCC No.9183）和耐高温、快速高产乳酸的戊糖片球菌（CGMCC No.9182）。 

戊糖片球菌，圆形菌落，乳白色，光滑，凸起，边缘整齐，不透明，革兰氏阳性，球菌。利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖，氨基葡萄糖和纤维二糖等多种糖产酸，耐酸、耐胆盐，具有很好的肠道定植能力。 

黑曲霉 ，黑褐色，顶囊大，球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙。菌丝发达多分枝，有隔多核的多细胞真菌。产酸性蛋白酶、植酸酶、纤维素酶和木聚糖酶等。 

戊糖片球菌的培养步骤为： 

戊糖片球菌经活化斜面接入MRS培养基37℃培养36h，而后以5%接种量进行逐级扩培12h，直至足够的固态发酵用量。

MRS培养基（g·L-1）：葡萄糖20，牛肉膏10，胰蛋白胨10，酵母膏5，K₂HPO₄ 2，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，MgSO₄ 0.1，MnSO₄·H₂O 0.05，吐温-80 1，pH自然，121 ℃灭菌20 min。