[发明专利]一种猪瘟病毒检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种猪瘟病毒检测方法。

背景技术

猪瘟病毒是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。病毒粒子呈圆形，大小为38～44nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。猪瘟病毒在细胞质内复制,不能凝集红血球，与牛腹泻病毒有相关抗原。该病毒对乙醚敏感，对温度、紫外线、化学消毒剂等抵抗力较强。    

利用RT-PCR检测病毒是一种非常灵敏的方法。通常RT-PCR灵敏度比cRNA探针的斑点杂交灵敏度高10-100倍（Nakahara et al, 1999）。RT-PCR对模板的纯度要求高，如果检测样品中存在扩增抑制物的话，将很难扩增出目的条带，尤其是果树类的材料，含有大量的多酚类和糖类等。糖类一般可以用乙二醇单甲醚来去除。PVP能有效束缚酚类化合物，在PCR混合物中加入PVP能有效地除去从组织中制备的RNA中的阻遏物（Koonjul et al, 1999）。但是PCR产物的检测常规方法是采用琼脂糖凝胶电泳进行，电泳后需要进行溴化乙锭染色后在紫外光下观察，溴化乙锭对人具有中等毒性和致癌性，易造成环境污染，这也严重限制了此方法的推广。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题而专门研制的一种猪瘟病毒的快速检测方法，该方法通过设计的可检测猪瘟病毒的通用引物，并将PT-PCR技术与核酸胶体金免疫层析技术相结合，建立的适用于猪瘟病毒的快速检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现的：

一种猪瘟病毒检测方法，主要包括以下步骤：

（1）    将患病仔猪组织病料充分研磨制成悬浮溶液，反复冻溶3次，离心取上清，按现有市场上的RNA提取试剂盒说明书要求，抽提RNA作为模板进行RT-PCR扩增待检测液；

（2）    取一定量待检测液，加入10×One step RNA PCR buffer，MgCl₂，DNTP Mixture，RNase Inhibitor，AMV-Optimized Taq，AMV RTase，正向引物，反向引物,用灭菌DEPC水补足，所述正向引物，反向引物分别标记了地高辛、荧光素；

（3）    采用常规方法制备胶体金溶液、胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物、层析试纸条，在检测点加入荧光素单克隆抗体，在质控点加入羊抗兔多克隆抗体；

（4）    将步骤（2）中所得PCR产物与胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物混合后插入试纸条，如果检测点和质控点均显色则为锦紫苏类病毒阳性结果，仅质控点显色则为阴性结果；

所述的通用引物为：

正向引物（F-primer）序列为5’-ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3’，

反向引物（R-primer）序列为5’-CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC -3’；

正向引物的5’端标记地高辛，反向引物的5’端标记荧光素。

所述的胶体金溶液的制备法如下：

（1）取1%氯金酸0.6 mL，加30 mL超纯水加热煮沸；

（2）加37℃预热的1%柠檬酸钠溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5 min，补水至总体积31.5 mL。

（3）冷却后，用0.2 mol/L K₂CO₃调pH至8.0-9.0，用0.45 μm滤膜过滤，4℃保存。

所述胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物的制备方法如下：

（1）取纯化好的兔抗地高辛多克隆抗体300 μg，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金液18 mL，室温搅拌30 min；

（2）加入10%牛血清白蛋白1 mL，室温搅拌5 min；

（3）加入10%聚乙二醇0.4 mL，室温搅拌5 min；

（4）12，000 r/min，离心30 min，去上清，加入2 mL保存液（取四硼酸钠0.1 g，BSA 0.25 g，溶于250 mL蒸馏水）悬浮沉淀；

（5）加入8 mL稀释液（取Na₂HPO₄·12H₂O 6.1 g，NaCl 8.5 g，PVP₄0 5 g，硼酸 2.1 g，PEG 1 g，10% BSA 50 mL，溶于1000 mL蒸馏水），取小量进行检定，其余置4℃保存。