[发明专利]一种猪瘟病毒检测方法

权利要求书

1.一种猪瘟病毒检测方法，主要包括以下步骤：

将患病仔猪组织病料充分研磨制成悬浮溶液，反复冻溶3次，离心取上清，按现有市场上的RNA提取试剂盒说明书要求，抽提RNA作为模板进行RT-PCR扩增待检测液；

取一定量待检测液，加入10×One step RNA PCR buffer，MgCl₂，DNTP Mixture，RNase Inhibitor，AMV-Optimized Taq，AMV RTase，正向引物，反向引物,用灭菌DEPC水补足，所述正向引物，反向引物分别标记了地高辛、荧光素；

采用常规方法制备胶体金溶液、胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物、层析试纸条，在检测点加入荧光素单克隆抗体，在质控点加入羊抗兔多克隆抗体；

将步骤（2）中所得PCR产物与胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物混合后插入试纸条，如果检测点和质控点均显色则为锦紫苏类病毒阳性结果，仅质控点显色则为阴性结果。

2.如权利要求1所述的猪瘟病毒检测方法，其特征在于：所述正向引物序列为5’-ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3’，反向引物序列为5’-CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC -3’，正向引物的5’端标记地高辛，反向引物的5’端标记荧光素。

3. 如权利要求1所述的猪瘟病毒检测方法，其特征在于，所述胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物的制备方法如下：

（1）取纯化好的兔抗地高辛多克隆抗体300 μg，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金液18 mL，室温搅拌30 min；

（2）加入10%牛血清白蛋白1 mL，室温搅拌5 min；

（3）加入10%聚乙二醇0.4 mL，室温搅拌5 min；

（4）12，000 r/min，离心30 min，去上清，加入2 mL保存液（取四硼酸钠0.1 g，BSA 0.25 g，溶于250 mL蒸馏水）悬浮沉淀；

（5）加入8 mL稀释液（取Na₂HPO₄·12H₂O 6.1 g，NaCl 8.5 g，PVP₄0 5 g，硼酸 2.1 g，PEG 1 g，10% BSA 50 mL，溶于1000 mL蒸馏水），取小量进行检定，其余置4℃保存。

4. 如权利要求3所述的猪瘟病毒检测方法，其特征在于，所述的胶体金溶液的制备法如下：

（1）取1%氯金酸0.6 mL，加30 mL超纯水加热煮沸；

（2）加37℃预热的1%柠檬酸钠溶液0.9 mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5 min，补水至总体积31.5 mL。

5.（3）冷却后，用0.2 mol/L K₂CO₃调pH至8.0-9.0，用0.45 μm滤膜过滤，4℃保存。