[发明专利]一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系

说明书

技术领域：                                      

本发明提供了一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系，可用于报告猪瘟病毒的感染以及猪瘟病毒分离培养、抗猪瘟病毒药物的相关研究，同时提供了相应的制备方法，属于细胞生物学技术领域。

背景技术：

病毒分离培养虽然是病原微生物检测的“金标准”，但还需用血清学或分子生物学方法进行进一步鉴定，此外整个诊断周期大约需要2-7天的时间。

免疫学方法一般检测待检样品中的猪瘟病毒抗体，而病毒的抗体产生一般需要在感染后7天左右，所以此法一般不用于CSF的早期诊断。且如需要获得病毒，还要进行病毒的分离培养实验。

分子生物学方法费用较高，同时易出现假阳性结果，且确诊CSFV感染后，如需要获得病毒，还要进行病毒的分离培养实验。

病毒感染报告细胞系既可用于病毒的检测，也可用于病毒的分离培养。目前公开发表的报告细胞系主要是基于激活LTR（长末端重复序列）及其下游报告基因的细胞系，且使用的报告蛋白主要是氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、萤火虫荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶等。这些细胞系在感染相关病毒后仍需要后续处理，才能最终得出检测结果，而不能快速、直观地报告病毒感染情况。另外，目前国内外关于猪瘟病毒报告细胞系的研究尚没有报道。

发明内容：

本发明公开了一种用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系，该细胞感染猪瘟病毒后，可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光，可用于检测猪瘟病毒的感染以及猪瘟病毒分离培养、抗猪瘟病毒药物的相关研究。

本发明还提供了猪瘟病毒感染的报告细胞系的制备方法，适用于人工制备该细胞系。

本发明提供的用于检测猪瘟病毒感染的报告细胞系，其特征在于：

该细胞含有CSFV特异识别的氨基酸序列、GFP荧光淬灭序列以及GFP蛋白。该细胞感染猪瘟病毒后，可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光；而未感染CSFV或感染其他病毒时，该细胞系不发出绿色荧光。

本发明公开了一种真核表达报告载体pEGFP-linker-quench，用于构建上述猪瘟病毒感染的报告细胞系。

本发明构建的真核表达报告载体pEGFP-linker-quench是在pEGFP-C1载体（Clontech）的基础上，插入人工合成的DNA片段而成。

本发明公开的pEGFP-linker-quench上插入的人工合成的DNA片段表达后形成荧光淬灭蛋白和CSFV特异性识别并剪切的肽段，且与GFP融合表达。

本发明公开的可编码荧光淬灭蛋白和CSFV特异性识别并剪切的肽段的DNA序列为：

5-agatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagctttgcaac

gattcaagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttggatcc-3。

本发明所述猪瘟病毒感染的报告细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1. 人工合成DNA片段

5-agatctacagaaacagaaacagaaacagaaacagaaacagaattgaaggagctagctcagggggataagctttgcaacgattc

aagtgatcctcttgttgttgccgcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttggatcc-3，其中划线部分分别为Bgl II和BamHI酶切位点。 

2. 真核表达报告载体pEGFP-linker-quench的构建

将上述合成的DNA片段经Bgl II和BamHI双酶切后，连接到真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点上，构建成真核表达报告载体pEGFP-linker-quench。

3. 猪瘟病毒感染的报告细胞系的建立

将上述构建的真核表达报告载体pEGFP-linker-quench用AseI酶切线性化，用脂质体法转染到PK-15细胞中，对经抗性筛选获得的阳性细胞进行鉴定，对鉴定正确的阳性细胞进行冻存。