[发明专利]一种利用SUMO系统表达HMGB1 A-box蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体地说，是一种利用SUMO系统高效可溶性表达HMGB1 A-box蛋白的技术。

背景技术

HMGB1 A-box的生产目前主要利用蛋白质工程技术和融合技术。

1.利用蛋白质工程技术，使用大肠杆菌作为以重组技术工业生产蛋白质的优选宿主细胞生产HMGB1 A-box。尽管大肠杆菌表达系统具有表达量高、易于培养和操作以及生产成本低等优点，但是，使用该表达系统仍难以直接获得大量可溶性的HMGB1 A-box，其原因在于HMGB1 A-box分子量小，极容易形成“包涵体”，即无生物学活性的不溶性聚合体。此外，即使获得大量的包涵体，为了得到有生物学活性的蛋白，还必须对包涵体进行变性—复性处理，这个过程往往损失大量的蛋白。

2. 采用传统的融合技术，将HMGB1 A-box基因与具有协助蛋白质正确折叠的融合蛋白如谷胱甘肽硫转移酶(GST)等进行融合表达。尽管蛋白的可溶性及收率有所提高，但是，耗时、昂贵的蛋白酶费用以及存在的蛋白酶水解靶蛋白的风险，常常不能获得令人满意的HMGB1 A-box产量。

但是关于利用SUMO系统高效可溶性表达HMGB1 A-box蛋白的技术目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用SUMO系统表达HMGB1 A-box蛋白的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种利用SUMO系统表达HMGB1 A-box蛋白的方法，包括以下步骤：

a、以包含HMGB1的质粒为模板，设计引物扩增A-Box结构域，将扩增后的目的基因A-Box亚克隆进pSumo-Mut表达载体的Stu I 和Hind III之间，目标基因N端融合了Sumo标签蛋白，获得pSumo-Mut-A-Box质粒；

b、使用重组质粒转化ArcticExpress^TM (DE3)原核宿主菌，使用IPTG诱导表达目的蛋白，将诱导条件调整至11度，通过Ni亲和纯化获得sumo-A-Box融合蛋白；

c、再通过sumo蛋白酶酶解，将sumo融合蛋白与A-Box分离，再进行Ni柱亲和纯化，去除残留的Sumo-A-Box融合蛋白、Sumo融合标签以及sumo蛋白酶，最终获得高纯度的A-Box蛋白。

所述的步骤a中扩增A-Box结构域的引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

所述的步骤a中获得的pSumo-Mut-A-Box序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明优点在于：

    1、通过在表达载体中引入SUMO融合标签，显著提高了外源蛋白的可溶性表达水平，促进其正确折叠，保证其生物学活性；

2、通过SUMO蛋白酶I对目标蛋白和融合标签进行分离，并且由于融合标签和蛋白酶都具有组氨酸标记，在通过层析柱时两者均可被吸附，达到一次洗脱目的蛋白的效果，不仅得到的蛋白纯度较高，而且大大节约了研究的时间和成本。

附图说明

图1. pSumo-Mut-A-Box测序验证序列。

图2. pSumo-Mut-A-Box质粒酶切验证结果。

    图3. pSumo-Mut-A-Box质粒构建图谱。

图4.融合蛋白A-BOX-SUMO 的电泳分析。Lane M:蛋白分子质量标准；Lane 1:未诱导菌体；Lane 2, 3: IPTG诱导后菌体。

图5. A-BOX-SUMO融合蛋白纯化电泳分析。Lane M:蛋白分子质量标准；Lane 1: 0.2mM IPTG、11℃诱导后沉淀液；Lane 2: 0.2mM IPTG、11℃诱导后上清液；Lane 3:流出液；Lane 4:洗脱液；Note:红色箭头指示目标蛋白。

图6.Ni柱亲和纯化A-BOX-SUMO蛋白电泳分析。Lane M:蛋白分子质量标准；Lane 1: sumo融合蛋白；Lane 2:酶解混合物；Lane 3:流出液:目标蛋白；Lane 4:洗脱液: sumo标签。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、实验设计