[发明专利]高GC含量大片段DNA的体外组装方法及应用

说明书

本发明涉及一种DNA体外组装方法，具体地，本发明涉及高GC含量大片段DNA的体外组装方法及应用。更具体地，本发明人利用改进的Gibson组装方法，在体外成功拼接了来自始旋链霉菌的原始霉素II生物合成基因簇，其可适用于高GC含量DNA大片段组装，并可以明显提高组装效率并简化组装过程。

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，具体地，本发明涉及一种高GC含量大片段DNA的体外组装方法及应用。

背景技术

微生物(尤其是放线菌)产生的具有生物活性的天然产物(次级代谢产物)，是人类抵抗癌症、衰老和感染性疾病等的宝贵财富。据统计，在已报道的天然药物中，有50％左右是由放线菌科的细菌产生的。同时，生物信息学分析显示，已完成测序的放线菌基因组中除了已知功能天然药物的生物合成基因簇外，还含有大量的隐形天然产物生物成基因簇，这些信息为将来新功能天然药物的筛选挖掘提供了宝贵的资源库。随着细菌耐药性问题日益严峻，从放线菌资源库中开发挖掘抗耐药性菌株感染的新天然药物变得尤为重要，而其中天然产物生物合成基因簇(一般可达20-150kb)的快速克隆，将是重要的关键技术之一。传统建库筛选的方法操作步骤繁琐，耗时耗力。随着合成生物学的发展，各种DNA体外组装方法相继诞生，如DNA assembler与Gibson等温一步法。由于体外操作与方法设计的简便性，它们为快速克隆天然药物的生物合成基因簇提供了一种新方式。Gibson等温一步法由于操作简单、组装尺度大(目前拼接的最大分子尺度为580kb)，已被广泛用于各个实验室，但还未见报道用于高GC含量DNA大片段(主要针对放线菌天然产物生物合成基因簇)的组装。

Gibson等温一步法主要利用体外同源重组原理，在一个反应体系中，可一次同时组装多个片段。该方法涉及三种酶，T5外切酶产生片段间重叠区的粘性末端，Phusion聚合酶与Taq连接酶修补缺口。在拼接低GC含量片段(小于40％)时，组装效率可达100％。但文献报道显示，随着片段与载体重叠区GC含量的增加，组装效率逐级下降，当GC含量为40％时，效率为80％，而当GC含量升高至60％时，效率仅有30％。推测主要原因是反应在较低温度(50℃)进行，当GC含量升高后，片段末端由于退火温度过高不易解链或者解链后易发生错配，导致载体自连或者片段间错误连接。而放线菌来源DNA的GC含量一般都超过70％，用传统的Gibson等温一步法显然无法满足拼接要求。本发明人的实验结果也证实了这一点，当在载体末端引入来自组装片段的40bp重叠区，组装3个5kb的DNA片段时(片段GC含量大于75％)，其组装效率为0。于是，本发明人对这种方法进行了改进，改进后可明显提高组装效率。最后，运用改进的方法应用于始旋链霉菌原始霉素II生物合成基因簇(67kb)的组装，验证了方法的有效性，因此，该方法为放线菌来源的天然产物生物合成基因簇以及各种高GC含量大片段DNA的快速克隆提供了很好的操作工具，本方法的推广应用将能有效地推动新天然药物挖掘开发的进度。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的高GC含量DNA大片段的体外组装方法，并用于原始霉素II生物合成基因簇的快速克隆。

在本发明的第一方面，提供了一种靶核酸序列的体外组装方法，包括步骤：

(a)提供用于拼接的n个结构单元，各结构单元的序列记为Ln，其中所述的n为≥2的正整数；和线性化的载体元件；

其中，

(i)所述的n个所述结构单元可拼接成式I所示结构的、两端分别带有第一和第二重叠区以及第一和第二限制性内切酶酶切位点的第一级拼接序列：

L1-L2-L3-…-LN (I)

式中，

L1、L2、……、Ln为各结构单元的核苷酸序列；

并且，位于第一级拼接序列的5'端的L1具有从5'至3'方向的式II所示的结构：

X0-X1-X2-X3-L1' (II)