[发明专利]杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株

的抗Nodal单克隆抗体和多克隆抗体及检测肿瘤细胞方面的应用。

背景技术

目前，早期诊断癌症的最便捷的方法是通过验血寻找肿瘤标志物，肿瘤标志物是指在肿瘤发生、发展过程中能反映细胞恶变的一些细胞内物质。临床上通过对各种肿瘤标记物的检测，可以对辅助相应肿瘤做早期诊断、判断预后、检测疗效和肿瘤复发状况的判断等。

Nodal属于TGF-β家族成员，它是一胚胎期高表达、而在成体组织中几乎没有表达的蛋白质。Nodal在细胞内以无活性的前体形式存在，在经过一系列加工修饰除去N端信号肽和一段包含200多个氨基酸的前肽序列后，便形成由110个氨基酸的成熟Nodal蛋白被分泌至胞外，成熟Nodal蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，分子量约为12kDa（人和小鼠的结构非常接近，氨基酸一致性达98.29%）。其中，通过比对TGF-β家族蛋白分析所得Nodal高特异性序列如SEQ ID NO:2所示。Nodal蛋白的功能是介导胚胎发育中外胚层的上皮细胞向内、外胚层之间迁徙以形成间质组织。已知在胚胎发育过程中，Nodal信号主要通过细胞膜上丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样I型受体（ActRI）和II型受体（ActRII）的介导传入胞内。活化的ActRI （ALK4或ALK7）随即激活胞内调节蛋白Smad (Sma/Mothers Against Decapenta-plegic)家族的Smad2/Smad3复合物。此后该复合物与Smad4形成具有活性的三聚体并转运至胞核内，结合到目的基因的顺式作用元件或启动子区域，调控相关基因的转录，参与了肿瘤恶性生物学行为的发生过程。

新近，人们发现Nodal蛋白在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、胃癌、神经胶质瘤等多数肿瘤中再度表达，且其表达水平与肿瘤浸润、转移和预后不良有关系。因此，通过检测血清中Nodal蛋白的表达情况，有望成为一种更加快速、方便、准确广泛的肿瘤体外普查诊断方法。

目前，对血清中蛋白的表达情况监测方法通常需要用到抗体，因此，研制一种效价高、特异性好的Nodal蛋白抗体十分必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对Nodal蛋白抗体及其相关技术的不足，提供一种杂交瘤细胞株，基于所述杂交瘤细胞株，可以产生优异的抗Nodal的抗体。

本发明要解决的另一技术问题是提供抗Nodal的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明要解决的还一技术问题是提供抗Nodal的单克隆抗体或多克隆抗体的应用。

本发明基于上述应用，提供一种将可以应用于用于肿瘤检测方面的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO.9105。

本发明提供优选的上述杂交瘤细胞的制备方法为：

以SEQ ID NO:1所示序列的成熟Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行活性筛选得到第一阳性克隆，以SEQ ID NO:2所示序列的特异性Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行特异性筛选得到阳性克隆，经3次亚克隆至阳性克隆率为100%，制得杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9105。

本发明提供一种抗Nodal的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC NO.9105的杂交瘤细胞株产生。

基于所述杂交瘤细胞产生的所述单克隆抗体的类型为IgG，具有良好的特异性与较高的效价。经检测，其效价可达1:1024000，在Western Blot检测中，本发明提供的抗体仅识别目标位置的Nodal特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。

本发明提供所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，尤其是在制备检测Nodal蛋白的检测工具中具有较好的应用。

本发明提供的单克隆抗体在制备检测肿瘤细胞的试剂中的应用。

作为优选，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。

本发明提供所述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

S01：以Nodal蛋白与弗氏完全佐剂混合，免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾细胞；