[发明专利]杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用

权利要求书

1.一种杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO.9105。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，以SEQ ID NO:1所示序列的成熟Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行活性筛选得到第一阳性克隆，以SEQ ID NO:2所示序列的特异性Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行特异性筛选得到阳性克隆，经亚克隆至阳性克隆率为100%，制得。

3.一种抗Nodal的单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生。

4.权利要求3所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于制备检测Nodal蛋白方面的检测工具或在制备检测肿瘤细胞的试剂方面的应用。

5.根据权利要求4所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，其特征在于，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。

6.权利要求3所述抗Nodal的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S01：以Nodal蛋白与弗氏完全佐剂混合，免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾细胞；

S02：将小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，获得所述杂交瘤细胞AH12，体内诱生或体外培养，经纯化，即得。

7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述单克隆抗体和抗Nodal的多克隆抗体；

所述抗Nodal的多克隆抗体的制备方法为：以Nodal蛋白免疫新西兰兔，免疫4次后收集血清，经Protein A柱亲和纯化，即得。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还包括以下包被液和封闭液等组成；

所述包被液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST；

所述封闭液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST。

9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还包括HRP标记的羊抗鼠抗体、nodal标准品、底物缓冲液、体积分数为30%的双氧水、邻苯二胺、摩尔浓度为2M的浓硫酸；

其中，底物缓冲液的配制方法为：称取柠檬酸19.2g，加水至1000 mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000 mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即得。

10.权利要求7、8或9所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S11：以包被液稀释本发明所述多克隆抗体，4℃放置16h，将该多克隆抗体包被至96孔板，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；

S12：加入封闭液，37℃封闭2h后，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；

S13：加入待测样品、由保藏编号为CGMCC NO.9105的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体，37℃封闭2h后，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；

S14：加入HRP标记的羊抗鼠抗体，18～30℃孵育2h，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；

S15：加入邻苯二胺显色液，显色15min后，以摩尔浓度为2mol/L的硫酸终止反应，检测OD₄₅₀。