[发明专利]一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法。

背景技术

外来生物入侵对我国生态环境和社会发展构成严重威胁，造成了重大的经济损失，抵御外来生物入侵，保护国境安全，是出入境检验检疫刻不容缓的职责和义务。随着海上航运业的快速发展，船舶压载水及沉积物带来的海洋生物入侵问题日益严重，海洋生物入侵会破坏海洋生态系统结构与功能，并造成一定的经济损失。船舶压舱水及沉积物携带的海洋生物可以存活数月，并随着压舱水的排放而进入其他水域，这为不同水域间一些物种的传播提供了一个便利的媒介。外来物种在新的适宜生存环境中的异常繁殖，会对近岸水域的生态系统带来灾难性破坏，甚至导致本土物种的灭绝。20世纪60年代以来北美五大湖共发现40余个外来物种，而旧金山湾在1970年后出现了50多种外来生物。为防止船舶通过压载水及沉积物转移外来生物和病原体，国际海事组织制定《船舶压载水及沉积物控制和管理国际公约》及相关导则。

海洋浮游动物如枝角类、桡足类等，在其生活史阶段会产生休眠细胞以度过不良环境条件，因此可以长时间在船舶压载舱沉积物中存活。如Kelly对从日本到达美国塔克马和安吉里斯港的木材运输船中的压载水沉积物进行了检测，其中也发现了存活的软体动物幼体和浮游甲壳纲动物。Bailey对进入大湖区9艘船舶压载舱沉积物中的休眠细胞萌发进行了实验，在孵化出的浮游动物种类中发现4种外来入侵生物。

目前对沉积物中外来生物的鉴定多依赖于实验室原位萌发实验，对沉积物中休眠细胞萌发后的浮游动物幼体进行形态学鉴定，从而判定是否为入侵生物。该方法耗费时间长，并且要求检验检疫人员具有丰富的生物学分类经验，严重制约船舶压载舱沉积物中外来生物检验检疫工作的开展。而从船舶压载舱沉积物中分离活体细胞并进行分子生物学鉴定，将大大缩短对船舶压载舱沉积物中外来入侵生物进行种类鉴定的时间。

由于浮游动物休眠细胞个体微小(多为直径几十微米)，从船舶沉积物压载舱沉积物中分离活体细胞十分困难，因此急需建立一种从船舶压载舱沉积物中快速分离活体细胞的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种步骤简单、操作简便、检测快速精确的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法。

一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，包括如下步骤：

(1)采集船舶压载舱的沉积物，置于培养皿内；

(2)用过滤海水冲洗沉积物，并采用第一筛绢过滤，保存冲洗后的液体；

(3)将保存的液体采用第二筛绢过滤，保留所述第二筛绢上的残留物；

(4)用饱和蔗糖溶液冲洗所述第二筛绢上的残留物至离心管；

(5)将所述离心管离心；

(6)吸取所述离心管的所有上清液，采用第三筛绢过滤，保留所述第三筛绢上的残留物；

(7)用过滤海水漂洗所述第三筛绢上的残留物至培养皿中，实现活体细胞的分离，在显微镜下观察活体细胞。

本发明所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中所述第一筛绢的孔径为200～250微米，所述第二筛绢和所述第三筛绢的孔径为30～50微米。

本发明所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中步骤(4)中所述饱和蔗糖溶液的浓度为200-220克蔗糖/100毫升蒸馏水。

本发明所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中步骤(5)中的所述离心采用台式离心机，转速为1000-1200rpm，离心时间为3-5分钟。

本发明所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中步骤(2)和(7)中的过滤海水为0.15微米滤膜过滤后的海水。

本发明所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中步骤(1)中称取5克所述沉积物置于培养皿内，步骤(2)和步骤(7)中的过滤海水的用量均为100毫升，步骤(4)中所述饱和蔗糖溶液用量为100毫升。

本发明船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法与现有技术不同之处在于：

本发明船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法能够从船舶压载舱沉积物中快速分离活体细胞，步骤简单，可以实现分离快速，所分离的活体细胞样品可用于出入境检验检疫工作中外来入侵生物的分子生物学物种鉴定。