[发明专利]miRNAs在胃癌干细胞中表达谱的分析方法

权利要求书

1. 一种miRNAs在胃癌干细胞中表达谱的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）胃癌干细胞的分离鉴定：选取三种或三种以上胃癌细胞株，采用悬浮球培养法分离出球体细胞；收集球体细胞与亲代贴壁细胞，检测干性基因CD44、Sox2、Oct3/4和Nanog表达，检测化疗耐受性及裸鼠成瘤能力；

（2）胃癌干细胞miRNAs表达谱分析及靶基因预测：收集悬浮球体细胞与亲代贴壁细胞，基因芯片分析悬浮球体细胞与亲代贴壁细胞的miRNAs的差异表达谱；PCR进一步检测验证球体细胞与亲代贴壁细胞差异表达的miRNAs；采用生物信息学技术预测靶基因，并分析其生物学功能。

2.根据权利要求1所述的一种miRNAs在胃癌干细胞中表达谱的分析方法，其特征在于，所述步骤（1）具体包括以下步骤：

①选取至少三株胃癌细胞株分别进行培养；

②收集贴壁细胞置于含无血清的RPMI-1640培养液96孔超低粘附板中培养，培养液中含浓度1% N-2 添加剂，浓度2% B-27 添加剂，浓度为1% 青链霉素，20 ng/ml 成纤维细胞生长因子2（FGF-2）和100 ng/ml 表皮生长因子（EGF），观察悬浮球形成球体的情况；

③第一代球体细胞培养到二周，将球体细胞吹散，重新置于RPMI-1640培养液96孔超低粘附板中培养，二周以后观察球体形成情况；重复上述方法连续培养并传代6代以上，提取球体细胞；

④将收集的球体细胞分成三份，通过球体细胞干性基因的检测、裸鼠活体致瘤实验和化疗抵抗试验测定其干细胞特性。

3.根据权利要求1所述的一种miRNAs在胃癌干细胞中表达谱的分析方法，其特征在于：所述步骤（1）的①中选取的胃癌细胞株为MKN-45、BGC823、NCI-N87以及SGC7901。

4.根据权利要求1所述的一种miRNAs在胃癌干细胞中表达谱的分析方法，其特征在于：步骤（2）中差异表达miRNA的验证具体为：选择10个有差异表达的miRNAs作进一步的qRT-PCR验证。

5.根据权利要求1所述的一种miRNAs在胃癌干细胞中表达谱的分析方法，其特征在于：所述步骤（2）中选择的10个有差异表达的miRNAs分别为：miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-21-5p、 miR-27a-3p、miR-22-3p、miR-4270、miR-483-5p、miR-16-5p、let-7b-3p和miR-34a-5p。

6.根据权利要求1所述的一种miRNAs在胃癌干细胞中表达谱的分析方法，其特征在于：步骤（2）中差异表达miRNA的生物信息学分析具体为：

（a）分析目标

根据悬浮球细胞与亲代贴壁细胞差异表达的microRNAs的结果及验证分析结果，预测这些microRNAs对应的靶基因，并对这些靶基因的可能功能进行网络分析，从系统生物学水平推测胃癌干细胞中microRNAs所调节的关键性分子和网络；

（b）分析方法

对于10个有差异表达的miRNAs，采用MiRanda, TargetScan以及Pictar三个在线数据库的交集，对10个miRNAs的靶基因作预测，并进行生物信息学分析；三个在线数据库的网址分别是：miRanda ：http://microrna. sanger.ac.uk；TargetScan ：http:// www.targetscan.org；PicTar:http://www.ncrna.org/KnowledgeBase/link- 

Database/mirna_target_database。