[发明专利]一种用于在米曲霉细胞分泌表达外源蛋白的表达设备及其米曲霉基因工程菌

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种用于在米曲霉细胞分泌表达外源蛋白的表达设备及其米曲霉基因工程菌。

背景技术

米曲霉(Aspergillus oryzae)是发酵工业常用的菌株，是一种好气性真菌，属于半知菌亚门、曲霉属。菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色；米曲霉菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除蛋白酶外，还可用来分泌淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、糖苷酶、脂酶、肽酶和植酸酶等；其中，工业上常见的高峰淀粉酶(TAA)即源于米曲霉的α-淀粉酶。米曲霉是被FDA认定的安全微生物(GRAS)，广泛应用于酿造业、调味品、饲料制造业、纺织、造纸、制浆等工业领域，并已被安全使用1000多年。目前，米曲霉RIB40已全基因测序，基于米曲霉的丝状真菌表达系统也越来越受到广泛关注。

除具有极好的合成和分泌蛋白的能力以外，A.oryzae还具有真核微生物的蛋白分泌机制和与哺乳动物系统相似的蛋白质翻译后修饰、加工性能；其表达系统与原核表达系统相比具有很大的优势，比如外源蛋白表达后的蛋白修饰、内含子识别、信号肽剪除和肽链的正确折叠及蛋白分泌。由于其适于蛋白生产的诸多优点，而且对人类没有毒性，米曲霉也已成为相关研究人员开展真菌细胞学、遗传学和生理生化研究的重要生物材料。日本资助支持了米曲霉基因组的测序工作，目前全基因组序列已经完成并公布。米曲霉全基因组测序的完成为利用功能基因组学方法研究具有重要生物学意义的功能基因奠定了基础(Machida M et al.Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae.Nature,2005,438:1157-1161)。

自上世纪80年代以来，丝状真菌表达系统被相继报道，同源蛋白的高产量表达已经证明，但是在相同条件下外源蛋白的表达大多数依然处于～mg/l，且由于丝状真菌不存在天然质粒，基因组数据较大，分泌表达过程复杂，造成目前尚未有如同大肠杆菌和毕赤酵母一样工业化生产的表达系统(包括表达宿主和表达质粒)。通过筛选米曲霉相关营养缺陷型，构建相应的回补表达载体，通过强启动子、融合表达等手段实现来源于真菌和动植物基因的异源表达已有相关报道(Minetoki T et al.Improvement of promoter activity by the introduction of multiple copies of the conserved region III sequence,involved in the efficient expression of Aspergillus oryzae amylase-encoding gene.Appl Microbilo Biotechnol,1998,50(4):459～467.Shiba Y et al.High level secretory production of phospholipase A1by Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus oryzae.Biosci Biotechnol Biochem,2001,65(1):94～101)。1997年，Randy M.Berka等在米曲霉pyrG影响缺陷型系统中通过以PamyB和TamyB的控制嗜温真菌Myceliophthora thermophila漆酶基因的异源表达，但表达量仅为～10mg/l(Novo N Biotec.Characterization of the gene encoding an extracellular laccase of Myceliophthora thermophile and analysis of the recombinant enzyme expressed in Aspergillus oryzae.Appl Environ Microbiol,1997,63(8):3151-3157)；2011年Nobuo Yamashita等在米曲霉中以sC为筛选标记，将来自于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的蛋白酶抑制剂基因置于米曲霉TAA启动子和终止子之间，通过诱导培养后实现该基因的异源表达(Nobuo Yamashita et al.High-yields heterologous production of the novel Aspergillus fumigatus elastase inhibitor AFUEI in Aspergillus oryzae,J biosci bioeng,2011,112(2):114～117)。尽管如此，迄今为止尚未有关于这些营养缺陷型系统相应的通用的可更换元件的可纯化的通用表达载体的报道。