[发明专利]一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因，属于基因工程技术领域。 

背景技术

肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS)两者具有相同的主链结构，是通过20-100个由D-葡糖醛酸/L-艾杜糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成二糖连接而成的直链多糖，糖链中不同部位的羟基(-OH)及N-乙酰葡糖胺2位氨基的乙酰化或硫酸化使Hep/HS的结构变得异常复杂(Castelli et al.2004；Casu2005)。Hep/HS广泛分布于哺乳动物的细胞表面和胞外基质中，在各种生命过程中起着重要作用，如：调节血管壁功能，凝血，炎症反应和细胞分化等。 

肝素酶(Heparinase)是研究Hep/HS构效关系的重要工具酶。肝素酶广泛存在于微生物和动物体内，通过选择性切割Hep/HS多糖链对Hep/HS的降解代谢和生物学功能进行调节。无论微生物还是哺乳动物来源的肝素酶对Hep/HS糖链的切割均具有结构选择性。哺乳动物来源的酶是通过对己糖醛酸和葡萄糖胺之间的糖苷键的水解作用来降解糖链的，而微生物来源的肝素酶则是通过β-消除机制对葡萄糖胺和己糖醛酸之间的糖苷键进行切割，在己糖醛酸残基的4、5位碳原子之间形成在232nm有特定紫外吸收的双键。哺乳动物来源的肝素降解酶参与了细胞信号转导，细胞迁移和癌变等各种生理病理过程。而微生物来源的肝素裂解酶则主要是参与微生物对肝素作为碳源的降解利用以及某些病原微生物对宿主的入侵过程。微生物来源的肝素酶由于种类多、酶活高、稳定性好、易于大量表达纯化、生产成本相对较低等优点，在科学研究、工业生产及临床上被广范应用。具有巨大的开发价值(Tripathi CK et al.2012)。 

三种来自于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的肝素裂解酶被广泛研究并做为主要的商品化肝素酶被广泛应用，被分别命名为为肝素酶I(Heparinase I)、肝素酶II(Heparinase II)、肝素酶III(Heparinase III)。这三种肝素裂解酶在降解肝素与硫酸乙酰肝素的能力上有差异，肝素酶I主要以降解肝素为主，肝素酶III主要降解硫酸乙酰肝素，肝素酶II既降解肝素也降解硫酸乙酰肝素(Linhardt et al.1987,1990)。这三个酶均为周质空间空间蛋白，早期主要是通过对菌体进行渗透压冲击或超生破碎并结合各种色谱对天然酶蛋白进行分离纯化，天然酶蛋白具有酶活高水溶性好等特点，但存在产量低、操作复杂、纯度难以保证和成本高等问题。 

自上世纪九十年代初开始，三种来自肝素黄杆菌的肝素酶被先后克隆表达(Godavarti et al.1996；Sasisekharan et al.1993；Shaya et al.2004)。但是，目前利用pET表达系统在大肠杆菌中表达肝素酶时，一直存在重组酶水溶性差，易形成包涵体，需要复杂的蛋白复性处理，且 复性蛋白不稳定，容易在保存过程中再度沉淀时候等问题。近年来，肝素酶I被广泛克隆到不同的表达载体与宿主中，但是依然面临着表达量低，活性低，水溶性差等问题，因此寻找和建立表达效率高、酶蛋白水溶性好、活力高的肝素酶重组表达技术具有重要的理论和现实意义。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种水溶性好、酶活力高的肝素酶I融合蛋白及其编码基因。 

一种肝素酶I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

一种肝素酶I融合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述肝素酶I融合蛋白的编码基因。 

上述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。 

一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了上述肝素酶I融合蛋白的编码基因。 

上述宿主细胞或细胞系选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。