[发明专利]一种检测鲑鱼种类的方法及其检测试剂盒和引物

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类检测领域，具体涉及一种检测鲑鱼种类的方法及其检测试剂盒和引物。

背景技术

鲑鱼是一类洄游性鱼类，广泛分布在大西洋、太平洋，在大陆淡水湖也能找到。研究发现，游进溪流的鲑鱼，90％都在同一溪流诞生。太平洋品种的鲑鱼，一般在繁殖后数周便会死亡。鲑鱼肉、肝、精巢和头均有药用价值。其肉有补虚劳、健脾胃、暖胃和中之功效，可以治疗水肿、消瘦、消化不良、膨闷胀饱、呕吐酸水、抽搐、肿疮等症。其肝可提制鱼肝油。其精巢可提制鱼精蛋白和配制成多种鱼精蛋白制剂，适应治疗过量注射肝素所引起的反应；它对某些出血症(如上消化道急性出血、肺咳血等)也有明显的止血作用，是提取制作鱼精蛋白注射液和精蛋白锌胰岛素的重要原料。

鲑鱼是鱼精蛋白制备的原材料来源。目前，用于鱼类鉴别的方法主要是采用传统的形态学鉴别法，即对完整鱼体进行形态特征比对，操作复杂，专业性强，但是，其最大缺陷在于需要结构完整的鱼体，不能有损坏。如果仅以鱼组织样品为材料，采用传统的整体形态学手段，则无法进行鱼类鉴别。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服传统的鲑鱼传统形态学鉴别法需要完整的鱼体进行形态特征比对，需要结构完整、不能有损坏的鱼体，使传统鲑鱼形态学鉴别法具有操作复杂，专业性强的缺陷。采用本发明的检测方法检测鲑鱼的种类，所需检测时间短，成本低，检测结果特异性高，检测结果判定方法简单。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一是：(1)提取待检测样本的基因组DNA，以其为模板，以特异性扩增引物对扩增待检测样本的基因组DNA，所述特异性扩增引物对的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，

(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，有特异性条带的待测样本属于大西洋鲑鱼(Salmo salar)或大马哈鱼(Oncorhynchus keta)。

根据本发明，步骤(1)中所述待测样本为本领域常规的待测样本，较佳地为待测鱼体的一部分，包括：鱼肉，内脏，鱼头，鱼白，鱼籽和鱼鳞中的一种或多种。

步骤(1)中所述提取待检测样本的基因组DNA的方法为本领域常规方法，所述方法较佳地包括以下步骤：

取鱼组织样品加液氮碾磨10min，或者100℃烘5-8小时，待烘干后碾磨10min。

取碾碎后的样品加入EP管，加入细胞裂解液1ml，加入蛋白酶K20μl，混匀。

在60-70℃的恒温水浴箱水浴10-40min，也可在30-40℃水浴12-24h，间歇震荡EP管数次。

裂解好后，台式离心机以12000-13000rpm离心5-10min，取上清液小心吸入另一离心管中。

加入2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用吸头挑出，晾干。

加入200μlTE重洗溶解，加入等量的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)震荡混匀，转速12000-13000rpm离心5-10min。

取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，震荡混匀，转速12000-13000rpm离心5-10min。

取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L的乙酸铵，然后加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，转速12000-13000rpm离心5-10min。

小心倒出上清液，吸水纸将管壁残余液滴除掉。

用1ml70％的乙醇洗涤沉淀物2-3次，转速12000-13000rpm离心5-10min。

小心倒掉上清液，EP管置烘箱37℃烘3-5小时。

其中步骤(1)中所述PCR反应的体系较佳地为1×PCR反应缓冲液，10～15mmol/L Mg²⁺，0.2～0.3mmol/L dNTP，0.1～0.3μM特异性扩增引物对，0.01～0.1U/μLTaq酶，10～100ng/μLDNA模板。更佳地为：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/LMg²⁺，0.25mmol/LdNTP，0.2μM特异性扩增引物对，0.04U/μLTaq酶和50ng/μL DNA模板。