[发明专利]一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法及检测方法，属于纳米材料与生物化学检测技术领域。

背景技术

微囊藻毒素（MC），即微囊藻素。从蓝藻水华中分离出的多肽毒素，具有水溶性、耐热性和相当的稳定性，加热煮沸都不能将毒素破坏；自来水处理工艺的混凝沉淀、过滤、加氯、氧化、活性炭吸附等也不能将其完全去除。微囊藻素易溶于水、甲醇或丙酮，不挥发，抗pH变化。化学性质相当稳定，自然降解过程十分缓慢。MC在去离子水中可保持稳定状态长达27d，在灭菌的河水中可保持稳定12d，而在普通河水中7d以内即会降解。它对蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A具有抑制作用，因此与肿瘤促进作用有直接关系。国内外研究最多的主要是MC-LR和MC-RR。MC的毒性和其结构相关，Adda是表达MC毒性的必需基团。研究表明，MC-LR的急性毒性最强，MC-YR次之，MC-RR最弱。在已报道的MC的80多种异构体中，MC-LR是最为常见的种类，且相关的毒理学研究最多，腹腔注射小白鼠的LD50值一般在50-60μg/kg（体重），因此，MC-LR的毒性可与化学类有机磷神经毒剂相当。

国内外的微囊藻毒素检测标准世界卫生组织（WHO）推荐的饮水中的藻毒素标准为1.0ppb。各国已有饮水中的藻毒素含量标准一般都为微囊藻毒素LR的含量，加拿大健康组织规定饮水中可接受的藻毒素标准为0.5ppb，澳大利亚学者建议1ppb的含量为安全饮用水的上限。中国微囊藻毒素的标准检测国标主要有：《饮用水的有机标准》GB/T5750.8-2006、《水中微囊藻毒素的测定》GB/T20466-2006、《地表水环境质量标准》GB3838-2002、《地表水和污水监测技术规范》HJ/T91-2002。随着中国水体的富营养化程度逐渐加剧，蓝藻水华和赤潮的发生逐渐增加。80%的蓝藻水华都可以检测出次生代谢产物---微囊藻毒素（microcystins，MCs），它对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。

传统检测方法采用物化分析方法，其中最主要的是：高效液相色谱法（HPLC）。液质联用法（LC-MS），HPLC-电喷雾电离质谱法（HPLC-ESI-MS）和超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）。这些方法需要昂贵的仪器和专业的操作人员，不适合用于现场检测。

免疫化学法是目前比较有前景的可以快速、灵敏的检测藻毒素的方法。免疫分析技术是指基于抗原和抗体之间的相互作用检测各种物质(如药物、激素、蛋白质、细菌等）的分析方法。抗原抗体之间的相互作用是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应，抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，依靠非共价键（静电引力、分子间作用力、氢键结合力和疏水作用）的相互作用进行结合，且抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡。利用微囊藻毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行检测。以免疫技术为基础，微囊藻毒素的免疫化学法包括酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、免疫亲和色谱法、胶体金法及免疫传感器法等。这类方法灵敏度较高、样品处理简单，便于操作，其检测限低于WHO水平，被认为是较有发展前景的方法。

免疫金标记技术（ICA技术）具有独特的优点，已成为第四大免疫标记新技术，是标记免疫分析方法的一种。胶体金免疫层析法的原理是将抗体标记到纳米金粒子上利用抗原抗体的反应对目标物质达到定量检测。由于具有简便、快速、低成本等优点，已经在激素检测、药物监管、癌症诊断等领域得到广泛应用。可以通过肉眼对颜色深浅做出判断，但是缺点是灵敏度低，基质干扰大。同时结合读数仪器可以达到半定量的检测，但是目前的读数仪器是基于灰度分析，对灰度值的细小差别分辨率低。