[发明专利]一种涂覆羧甲基纤维素偶联RGD短肽的细胞培养板的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种涂覆羧甲基纤维素偶联多肽的细胞培养板及其制备方法和在细胞培养中的应用，属于生物材料技术领域。

背景技术

聚苯乙烯具有透明度好、无毒、易清洗，可重复利用等优良特性，广泛用于细胞培养材料。但由于其表面自由能低，亲水性差，对聚苯乙烯进行改性以提高其表面生物相容性、增强细胞亲和力成为了一个重要的研究课题。

经过等离子体及电弧处理能改善聚苯乙烯表面亲水性，并且具有相对较好的生物相容性，但亲水性时间短，一般在处理后3天内表面活性基团消失。目前促进细胞贴壁使用的包被基质为Matrigel，是一种从EHS小鼠骨肉瘤分泌的细胞外基质。使用动物中提取的细胞外基质可能含有一些致病物质会损害细胞的生长和功能。近两年来对于培养表面的包被物研究略有进展，有报道可以使用重组的多种ECM混合，或单纯使用某种ECM蛋白来达到类似Matrigel的效果，但重组蛋白代价昂贵，而且不利于长期保存。近年来，人们逐渐认识到除了生化因素以外，细胞微物理环境(如弹性、表面微纳米形貌等)对细胞的迁移、增殖、表型和功能的维持、凋亡、分化有重要影响。目前已有文献报道合成材料表面可为细胞生长提供一个相对均一的环境并降低有害杂质的影响，因此在材料研究的基础上，如果能够开发出支持细胞贴壁生长并维持多能性的可控细胞微物理环境，对于细胞培养的实际应用有着很大的意义。专利CN1986778A发明了一种增加单核细胞贴壁数量的方法，缩短了单核细胞贴壁所需要的时间，获得大量能分化成树突状细胞的单核细胞，提高了树突状细胞制备的数量。专利CN103060264A公开一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，所述干细胞培养基中不含血清，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽。这些现有技术存在制备成本高，特别是CN103060264使用动物中提取的细胞外基质Matrigel，Matrigel是一种从EHS小鼠骨肉瘤分泌的细胞外基质，使用动物中提取的细胞外基质可能含有一些致病物质会损害细胞的生长和分化，不同来源细胞因子会影响细胞生长稳定性，因而在实际使用中会产生问题。近两年来对于培养表面的包被物研究略有进展，有报道可以使用重组的多种ECM混合，或单纯使用某种ECM蛋白来达到类似Matrigel的效果，但重组蛋白代价昂贵，而且不利于长期保存。

羧甲基纤维素是纤维素的羧甲基团取代产物,，具有良好的生物相容性，在生物材料上得到了广泛的研究。羧甲基纤维素是一种阴离子型线性高分子多糖类物质,外观白色或微黄色,无味、无臭、无毒,易溶于水成为黏稠性溶液,具有独特的理化特性,并具增稠、悬浮、乳化稳定、流变特性等功能。羧甲基纤维素通常以纤维素羧酸盐形式存在,以碱金属盐和铵盐的形式出现的羧甲基纤维素可溶于水,其溶于水后pH值接近中性。羧甲基纤维素具有良好的成膜性,高黏度、相对高分子质量的羧甲基纤维素制成薄膜后具有高强度和高柔软性。近年来,对羧甲基纤维素作为一种生物相容性材料在生物医学方面用于药物载体、预防粘连、整形外科、创面辅料等。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg—Gly—Asp)的短肽，作为整合素和其配体相互作用的识别位点，调节细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用。RGD短肽作为常见的整合素粘接位点介导细胞与细胞间及细胞与细胞外基质间的识别作用，调节细胞与细胞、细胞与基质材料间的粘附、迁移和分化，可有效促进细胞的贴壁生长和增殖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于细胞培养的涂覆有羧甲基纤维素的细胞培养板及其制备方法，并以该方法制得细胞培养板表面涂覆有生物相容性良好的羧甲基纤维素及偶联促进细胞贴壁生长的短肽。

本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种用于细胞培养的涂覆羧甲基纤维素的细胞培养板，在细胞培养板表面涂覆有一层羧甲基纤维素膜，所述膜上偶联有RGD多肽

本发明还公开了所述细胞培养板的制备方法，使用碳化二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及2-吗啉乙磺酸水合物(MHS)偶联方法在培养板表面接枝引入多肽。

具体的制备步骤如下：

(1)用电子天平称取羧甲基纤维素0.25～1g，用20ml的10～30％氨水混合，超声200～600秒，加10～30ml蒸馏水稀释，备用；

(2)将聚苯乙烯培养板用无水乙醇、蒸馏水洗三遍，真空干燥，备用。

(3)将步骤(1)中的溶液滴加到步骤(2)的培养板中，液面要完全覆盖培养板底部(约8滴)，然后将滴加过(1)溶液的聚苯乙烯培养板放入60℃真空干燥箱中30分钟；