[发明专利]源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用。

背景技术

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种之一。但是该除草剂同样是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。为了在农业生产中使用草甘膦，必须培育出具有草甘膦抗性或者降解性的农作物。

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，glyphosate）毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性。该合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）生物合成过程中的一个关键酶，该酶由aroA基因编码。

目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断扩大，占全球种植转基因作物的78%以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和南非等七国的主要商品化转基因农作物。耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的62%。然而现在应用于生产的抗草甘膦基因仅有两个，且都受到专利的保护，因此发掘新型的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因对于培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因作物将是非常有必要的。

最近，来自于极端微生物体内的好多酶都已成为研究的热点，主要是因为微生物生长在极端环境中从而使这些酶可能具有潜在的特殊的生物功能。极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotogamartima)是一种革兰氏阴性菌，该菌最适生长温度80^oC，在pH=5.5-9.0和NaCl浓度0.25%-3.75%之间生长，严格厌氧。在过去的几年时间里，很多来自该极端嗜热菌的酶被分离出来并进行研究了。然而来自该菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶还从未研究过，也未见对该酶功能的研究报告。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其应用，利用基因合成法制备海栖热袍菌aroA-Tm基因，并对该基因进行酶动力学特性分析和功能试验验证，以证明其具有较高的草甘膦耐受性。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA-Tm，其核苷酸序列如SEQIDNo1，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO2。

所述来源于海栖热袍菌的aroA-Tm基因，含1266个碱基，编码的氨基酸421个。

所述来源于海栖热袍菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因应用于草甘膦耐受性中。

所述的来源于海栖热袍菌的aroA-Tm基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，它是根据植物密码偏爱通过化学合成方法得到的。即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成（PTDS）（NucleicAcidsResearch，2004，32：e98）。

具体合成方法包括以下步骤：

引物设计：设计长度大概为60bp左右的覆盖整个5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的寡核苷酸的序列33个，其中每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。

PCR扩增：利用PCR进行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶扩增。其中，在100μl反应体系中，P2~P32共31个引物的添加量为2ng，两个外侧引物P1和P33的添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min，94℃30s，50℃30s，72℃10min，使用的TaqDNA聚合酶为KODFXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。

转化：PCR结束后，用1%琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，在DH5α感受态中高效转化，获得长度为1266bp的SEQIDNo1序列的阳性克隆，即为本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，经序列测定，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。