[发明专利]一种高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株及构建方法与应用。 

背景技术

菊粉是由β粉2，1-糖苷键连接的D-呋喃果糖分子组成的链状大分子，末端常含有一个葡萄糖基。菊粉酶(inulinase)是一种催化水解菊粉中β-2，1-呋喃果糖苷键的水解酶。根据其对底物的作用方式，可将其分为2类：一类是菊粉外切酶(exoinulinase)，它能从菊粉末端逐一切下一个果糖单位，产物为果糖及少量葡萄糖；另一类是菊粉内切酶(endoinμlinase)，它从菊粉分子内部随机切断某个β-2，1-糖苷键，水解产物为寡聚糖，可以用来生产低聚果糖。 

低聚果糖（Inulooligosaccharides，IOS）是功能性低聚糖，在食品、医药等方面具有极大的应用价值，相比于蔗糖，具有难消化性、食物纤维的作用、低龋齿性、促进双歧杆菌的增殖、改善脂质代谢作用等优越性，适合现代人们对食品安全性、健康性及功能性等需求的特点，逐渐成为菊粉生物转化应用中极其重要的方向。 

低聚果糖的生产方法主要有两种：一种是以蔗糖为原料利用呋喃果糖苷转移酶(Frucofranosidase)作用来制备，该方法的缺点是反应产物中生成大量的葡萄糖，通常占到35%以上，去除难度大，导致其生产成本的增加；另一种方法是以菊粉为原料利用微生物产出生产用的内切型菊粉酶酶解制备低聚果糖，该方法的优点势是只需一步酶解就可以生成80%以上的高纯度低聚果糖，产物中的葡萄糖含量极低，又由于菊粉的来源丰富，价格便宜，使得该方法具有非常广阔的应用前景。 

用菊粉酶法生产低聚果糖的工艺，对微生物具有较高要求，首先微生物所产的酶液中只能有内切型菊粉酶，而不能有外切酶及转移酶的存在；第二是微生物所产酶液中菊粉酶的酶活力要高、稳定性要好。因此，获得优良的产菊粉内切酶微生物是以菊粉为原料用菊粉酶解法生产低聚果糖能否工业应用的关键。然而自然界菌株中已知具有上述功能菌株一般表达水平很低并且既表达菊粉内切酶也表达菊粉外切酶，使的大规模生产困难而且产物纯化成本很高，所以到目前为止，菊粉内切酶生产低聚果糖的工艺没有真正实现在工业生产中规模化应用。因此，通过生物技术开发出酶活力高、产量大、热稳定性好的产菊粉内切酶菌株意义重大。经检索，目前具有高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的重组毕赤酵母菌株还未见报道。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种高水平表达菊粉内切酶单一酶组分的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株及构建方法与应用。 

本发明的技术方案概述：分别构建组成型和诱导型两种启动子所调控的菊粉内切酶 INU2基因的表达质粒，再将这两种质粒多拷贝整合在宿主巴斯德毕赤酵母的基因组上，获得高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，实现对菊粉内切酶INU2的高水平表达。 

本发明所述的高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于：所述菌株命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO：9049。 

上述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，步骤是： 

克隆菊粉内切酶基因INU2，将菊粉内切酶基因，通过限制性内切酶位点分别与毕赤酵母表达质粒pPIC9K和pGAPZαA连接获得重组表达载体pPIC9K-INU2和pGAPZαA-INU2；然后将pPIC9K-INU2导入巴斯德毕赤酵母GS115中，通过遗传霉素G418筛选得到多拷贝AOX启动子的转化子，再将pGAPZαA-INU2导入多拷贝AOX启动子的转化子中，通过博来霉素抗性筛选获得多拷贝GAP启动子的转化子；用实时荧光定量PCR确定多拷贝转化子的拷贝数，对不同拷贝数的转化子进行诱导发酵比较，确定出产量最高的双启动子多拷贝转化子，即获得高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株。 

上述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株的构建方法中：所述产量最高的双启动子多拷贝转化子优选是GS115-A3-G2，其中：GS115表示巴斯德毕赤酵母基因，A3表示有3个AOX启动子，G2表示有2个GAP启动子。 

本发明所述高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌在水解菊粉用于生产低聚果糖中的应用。