[发明专利]多个microRNAs复合检测的引物设计方法

说明书

技术领域

本发明属于法医学技术领域，具体涉及多个microRNAs复合检测的引物设计方法。

背景技术

法医物证鉴定通过对犯罪现场留下的生物性检材进行检测，可以得到对案件调查有用的信息。法医生物检材与一般生物检材不同，犯罪现场多是一些体液斑痕,如血痕、唾液斑、精液斑。确定这些体液斑痕的组织来源对明确案件性质有至关重要的作用，例如强奸案中证明犯罪嫌疑人身上的体液斑是来源于受害者的阴道分泌物或月经血会使犯罪嫌疑人难以将其解释为日常接触或物理攻击所形成。又如儿童性侵犯案件中，证明儿童内衣或床单上的生物斑痕是来自精液会使案件性质更加明确。

由于体液斑的组织来源鉴定在案件调查中的重要性,体液斑鉴定一直是法医学研究的重点之一。早期的相关检测多采用基于血清学的方法，然而这些传统的体液斑检测方法灵敏度各异，周期长，需要检材量大，一种试验只能分析一种体液，还会对检材造成破坏而不能进行下游的实验，并不适合法医实际工作中常常遇到的微量和降解检材。也有学者尝试用mRNA(200～300核苷酸)在组织中特异性表达的特征来进行体液鉴定，但由于其扩增片段较大，在法医常见的高度降解和陈旧样本中检测成功率低。近年来，microRNA的发现为体液斑组织来源问题的解决带来了新的希望。

microRNAs(miRNAs)属于一类非编码小RNA，长度约为18～25个核苷酸，它通过特异性结合相应的mRNA，导致mRNA的断裂或者翻译抑制，在转录后水平对基因的表达进行调控。与mRNA相比，miRNAs分子要小得多，理论上核酸分子越小越利于法医日常检案中常见的高度降解和陈旧样本的检测。2006年，Pranidhi Sood等报道了miRNAs具有细胞特异性，2007年，Yu Liang等在BMC Genomics上发表了miRNAs具有组织特异性的文章，miRNAs因此成为疾病诊断、预后判断等方面的研究热点。由于miRNAs分子小，适于微量和降解检材的检测，且其表达具有明显的组织特异性，因此miRNAs在体液斑痕组织来源的法医学鉴定中具有独特的优势。2009年，Hanson等首次将miRNAs作为鉴定法医相关体液的标记用于法医学研究。近年来，研究者运用实时定量PCR技术和基因芯片技术相继筛选出一些体液特异性的miRNAs标记，可用于体液的组织来源鉴定。然而，实时定量PCR技术和基因芯片技术在多数法医DNA实验室中并不是现有的常规技术。此外，在实际案件调查中，从犯罪现场收集的检材有时是微量检材。法医相关分析常常需要对微量体液斑痕进行多种体液特异性miRNAs标记的迅速检测，以判断体液斑究竟来源于何种组织。实时定量PCR技术和基因芯片技术难以满足对法医微量生物性检材进行多个miRNAs标记同时快速检测的要求。因此，建立适应法医学需要的检测技术，使基于特异性miRNAs的体液鉴定能在法医学实验室中广泛推广应用是目前有待解决的新问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是实现多个miRNAs的复合检测以及miRNAs和DNA的共平台检测，使基于特异性miRNAs的体液鉴定方法能在法医DNA实验室中广泛用于快速确定体液斑痕的组织来源。

本发明的技术方案是用于microRNAs检测的引物，包括特异性逆转录引物REP、上游引物PF和下游引物PR；所述的特异性逆转录引物REP从5’端到3’端方向依次包括接头序列ADP和P1，所述ADP从5’端到3’端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述P1为与待测miRNA标记3’末端互补的6～8个碱基；所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，所述上游引物PF从5’端到3’端方向依次包括非人类基因组序列TAS和P2；所述TAS的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述P2为待测miRNA标记序列中除P1的互补序列以外的碱基序列，且将U替换为T。

具体的,所述下游引物PR从5’端到3’端方向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS；所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No.5。

优选的，在上游引物PF或下游引物PR的5’端标记荧光物质。

SEQ ID No.1NHS：5’-GCTGTCAACGATACGCTACG-3’。

SEQ ID No.2TTTTC序列：5’-TTTTCTTTTCTTTT-3’。