[发明专利]丙型肝炎病毒(HCV)细胞进入抑制肽ZTE2序列及应用

说明书

技术领域本发明属于病毒分子生物学领域。涉及利用HCV包膜蛋白E2的多肽对HCV感染的防治。 

背景技术丙型肝炎病毒(HCV)为黄病毒属，单股正链RNA病毒，全长基因组约有9600个核苷酸组成，形成单一的开放阅读框，编码一个约3000个氨基酸的单一多蛋白，在病毒自身编码的蛋白酶及宿主编码的信号肽酶的切割加工下，形成4个结构蛋白(Core，E1，E2，p7)和6个非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。HCV引发的丙型肝炎，急性感染者中约80％发展为慢性，其中约20％发展为肝纤维化和肝硬化，并可能进一步发展为肝癌。目前全球约有1.7亿感染者，我国约有4000万，HCV感染已经成为全球性的社会公共卫生问题之一。 

丙型肝炎病毒的高度变异性，给疫苗的研究造成了极大的困难。目前对HCV感染的治疗从单一的聚乙二醇-干扰素(PEG-IFN)或者与利巴韦林(RBV)的联合用药外，直接靶向病毒的药物(DAAs)及靶向宿主的抗病毒药物(HTAs)陆续出现。美国FDA已经批准两种抑制HCV复制的药物，即直接靶向HCVNS3/4A蛋白酶的抑制剂，分别是Vertex公司的telaprevir及Merck公司的Boceprevir。另外靶向宿主的抗病毒药物也相继进入临床II期试验，包括靶向HCV进入宿主细胞受体SR-BI的抑制剂：ITX-5061等^[1]。虽然目前的治疗效果较好，但是副作用大，价格昂贵，因此寻找防治HCV感染的有效靶点仍然需要众多研究者共同努力。 

在病毒感染细胞的生物过程中，病毒与宿主细胞膜表面受体的特异性结合是病毒感染的最初环节，型别不同的同种病毒在与细胞结合过程中作用分子一般是固定的，如果能够阻碍两者之间的结合，即可以有效抑制病毒性感染的发生。2003年美国FDA批准抗人免疫缺陷病毒(HIV)的新药T-20(Enfuvirtide)上市，T-20是穿入抑制剂中第一个上市的药物，含有36aa，能够与HIV包膜蛋白gp41结合，阻止病毒与靶细胞的融合，临床试验证明效果较好，受试者副反应较小^[2]。 

目前已经证明HCV的包膜糖蛋白E1E2是与宿主细胞受体结合的唯一关键分子，其中E2被认为是最重要的分子。1998年Pileri等的研究表明人CD81(hCD81)可能是HCV的受体，随后低密度脂蛋白受体(LDLR)、清道夫受体B族I型(SR-BI)、钙离子依赖型(C型)凝集素DC/L-SIGN、Occludin和细胞连接骨架蛋白Clauding-1等都被证实是HCV的可能受体，目前比较一致的看法为HCV是通过包膜糖蛋白E2与CD81特异性结合，使病毒吸附于靶细胞表面，但由于CD81介导的内吞作用弱，病毒最终进入细胞可能还需要其他分子，如LDLR、SR-BI等来辅助，Clauding-1则在病毒穿入过程的后期起到关键作用^[3-8]。 

我们通过分析HCV基因型2a的参考株JFH-1(GenBank no.D95A86)包膜糖蛋白E1E2，人工合成覆盖完整E1E2氨基酸序列的多肽126条，其中E1有37条，E2有89条，每条多肽由15aa组成，相邻两条多肽有10aa重叠。运用HCVcc(FLJclp7NS2Gluc2a)对以上合成的多肽进行筛选，研究发现位于包膜糖蛋白E2氨基酸序列692-710aa位置的两条多肽E2-78，E2-79，在10nM的浓度下，对HCV感染的抑制率可以达到抑制80％左右，半数有效抑制浓度约为5nM。在研究多 肽与病毒作用关系的试验中，多肽与病毒共孵育(0h)和感染后孵育(+4h)的情况下，与阴性对照(DMSO)相比，多肽的加入能够明显抑制HCV感染Huh7.5CD81细胞，具体表现为感染细胞中HCV特异性蛋白Core的表达量下降，病毒RNA的拷贝数下降，细胞培养上清中Gluc荧光素酶的活性下降。该实验证明本次筛选获得的两条多肽，是通过阻止病毒进入细胞的生物过程而发挥作用的，具体是否是通过与病毒竞争性的结合靶细胞表面的受体的方式发挥抑制感染的效果，还需要深入研究。 

这一发现具有重要的意义，不仅可以帮助理解该新发病毒感染的过程和机制，也能为阻断HCV感染，尤其是肝移植病人再感染的预防治疗提供新的设计思路，希望能为研发理想的HCV预防/治疗性候选药物提供参考依据。 

发明内容：

本发明解决的问题在于提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)的多肽ZTE2，筛选能与HCV包膜糖蛋白E2结合的多肽序列，获得以HCV E2为靶位的多肽，以阻断病毒与细胞的结合，从而抑制病毒侵染细胞。