[发明专利]人多能干细胞培养基及人多能干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种人多能干细胞(hES/iPS)培养基及人多能干细胞的培养方法。

背景技术

1998年，美国Wisconsin大学Thomson(Thomson et al.,1998)等采用来自人工体外受精(in vitro ferlilization，IVF)的囊胚内细胞团，首先成功分离人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hES细胞)并培养建系。细胞具有高度自我更新能力，并能在体外培养条件下无限扩增。同时，hES细胞还能在一定条件下，分化成三个胚层来源的各种细胞。因此，hES细胞广泛应用于再生医学、药物筛选及胚胎发育生物学的研究，从建立以来一直是当今研究热点。

日本学者中山申弥(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通过导入四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的方法，分别成功将小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)，并因此获得了2012年的诺贝尔医学和生理学奖。hiPS细胞具备hES细胞的所有分化能力，并且没有伦理问题，在不久的将来会完全取代hES细胞，成为再生医学的最主要细胞来源。

hES细胞和hiPS细胞的最初采用的培养条件，都需要明胶包被和饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞，mouse embryonic fibroblasts,MEF)的支持。此外，传统培养基还采用成分复杂的敲除血清替代品(Knockout Serum Replacement,KOSR)作为主要的培养基添加剂。由传统培养条件产生的hES细胞和hiPS细胞，因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应，不能作为合适的细胞来源。同时，传统培养条件还很不稳定，容易影响实验进度和结果，造成损失。这主要是由于不同批次MEF的质量差异较大，而购买商品化MEF则极其昂贵，大多数培养者采用自制的MEF所致。

发明内容

本发明旨在提供一种人多能干细胞(hES/iPS)培养基及人多能干细胞的培养方法，以解决现有技术中人多能干细胞(hES/iPS)因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应及现有技术中的培养体系严重影响人多能干细胞(hES/iPS)体外扩增效能的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供一种人多能干细胞培养基。该人多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；添加剂包括碳酸氢钠400～600μg/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素生长因子10～30ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人乳铁蛋白7～13μg/ml、抗坏血酸50～70μg/ml以及重组人转化生长因子1ng/ml～3ng/ml。

进一步地，添加剂包括碳酸氢钠520～580μg/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素生长因子15～25ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人乳铁蛋白10～12μg/ml、抗坏血酸63～66μg/ml以及重组人转化生长因子1.5ng/ml～2.5ng/ml。

进一步地，添加剂包括碳酸氢钠543μg/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素生长因子20ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人乳铁蛋白11μg/ml、抗坏血酸65μg/ml以及重组人转化生长因子2ng/m。

进一步地，基础培养基保存在4～8℃，添加剂保存在-20～-80℃冰冻保存。

进一步地，人多能干细胞培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻添加剂；将添加剂与基础培养基以7:500的体积配混合后形成人多能干细胞培养基。

进一步地，人多能干细胞培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明的另一个方面，提供一种人多能干细胞的培养方法。该方法包括采用上述人多能干细胞培养基培养。

包括以下步骤：S1，将人多能干细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；S2，向培养皿中加入人多能干细胞培养基，每隔一天换一次人多能干细胞培养基。