[发明专利]一种基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的研究及应用。

背景技术

猪瘟(Swine Fever，SF)又名猪霍乱(Hog Cholera，HC)，欧洲也称之为古典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、急性传染病。其特征是发病急、高热稽留，微循环血管壁变性及其导致的全身泛发性小点出血，内脏器官中的多发性出血、坏死和梗死，具有很强的传染性和很高的致死率。被世界动物卫生组织（World organization of animal health，OIE）列为法定报告的动物疫病之一，我国将其列为一类动物传染病。猪瘟病毒基因组为单股正链 RNA，全长大约为12.3kb。其放阅读框(Open Reading Frame，ORF)编码的多聚蛋白经加工切割成12种蛋白质，其中 C、E0、E1、E2 等 4 种蛋白是成熟病毒粒子的组成成分，被称为结构蛋白；其余 8 种蛋白的为非结构蛋白。而E2蛋白是猪瘟病毒最主要的保护性抗原蛋白，在感染细胞中以同源二聚体或与E1形成异源二聚体形式存在于病毒粒子及感染的细胞表面。研究表明，E2蛋白的糖基化位点与病毒的毒力有着直接的关系。在四种结构蛋白中，E2蛋白保守性最低，最易发生变异。许多学者认为CSFV 的E2抗原变异有可能是导致该病毒逃脱或抵御免疫保护的主要原因。

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性人畜共患传染病。该病传播快，传播途径广，发病率高，对家畜养殖业危害极大，该病主要侵害牛、猪、羊和骆驼等家畜及多种野生偶蹄动物。被OIE列为法定上报疫病，而我国将其列为一类动物疫病的首位。口蹄疫病毒具有多型易变的特点，目前有7 个血清主型，分别为O、A、C、SAT 1、SAT2、SA T3 和亚洲Ⅰ型( Asia Ⅰ) 。我国口蹄疫的病毒型为O、A 型和亚洲Ⅰ型。口蹄疫病毒为单股正链RNA病毒，基因组全长约8500个核苷酸(nt)。其放阅读框(Open Reading Frame，ORF)共同编码一多聚蛋白。多聚蛋白经3次裂解后，形成3～4种病毒结构蛋白(VPO或VP4、VP2、VP3、VP1)和8~9种非结构蛋白。FMDV抗原变异是由衣壳蛋白VP1-VP4的氨基酸残基决定的。其中VPl最容易发生变异，它暴露于病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分，能诱导机体产生保护性的中和抗体；而VP4几乎不发生变异。FMDV抗原变异主要发生在FMDV衣壳蛋白VPl的G-H环上，是由抗原表位的氨基酸缺失、添加或替换造成的。FMDV的这种变异有可能使病毒突变株逃避抗体的中和或调理作用，获得持续感染的机会。

近年来，猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，出现了以繁殖障碍和仔猪先天性感染为特征的非典型猪瘟，表现为症状温和，隐形带毒，有些地区经常发生疫苗免疫失败或免疫无效的现象。而口蹄疫大面积爆发和流行一波未平一波又起，我国应用弱毒疫苗和灭活疫苗，取得了一定的防制效果。但无论是弱毒疫苗还是灭活疫苗都是由完整病毒粒子制成的疫苗，都无法逃避安全性问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：提供一种安全的基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的制备方法。

本发明的技术方案：一种基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

（1）猪瘟病毒病料CSFV-E2的RT-PCR扩增；猪O型口蹄疫病毒病料FMDV-O VP1的RT-PCR扩增；

（2）回收RT-PCR产物，与pMD19-T载体连接；将连接产物转化入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞培养，挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基中，振荡培养至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定，筛选出阳性并进行测序；

（3）将所构建重组质粒pMD19-CSFV-E2与pcDNA3.1（+）载体分别进行BamH I和EcoR I双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得阳性重组质粒pcDNA3.1-CSFV-E2，利用试剂盒提取质粒，进行BamH I和EcoR I双酶切及PCR鉴定，并送测序验证；