[发明专利]番鸭呼肠孤病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及番鸭病毒检测技术领域，具体涉及一种番鸭呼肠孤病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法。

背景技术

番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)引起的番鸭、半番鸭及鹅的一种急性传染病，临床主要病变特征有软脚、腹泻和生长发育不良，以肝、脾表面有大量灰白色坏死点为主要病变表现，俗称番鸭肝“白点病”或“花肝病”，本病多发于10～45日龄的番鸭，发病率通常为30％～90％，病死率一般为60％～80％，严重时可导致全群死亡，造成番鸭养殖业的巨大经济损失。

1972年法国学者首次从患病番鸭中分离鉴定了番鸭呼肠孤病毒，其后，以色列(1981)、意大利(1984)、德国(1992)等地相继报道并证实了本病。从1997年开始，该病在我国的福建、浙江、广东、江苏和江西等番鸭饲养区爆发流行。此外，2005年以来，在福建省的莆田、福州、广东省佛山和浙江省等地的番鸭、半番鸭、野鸭、麻鸭和鹅群又发生一种以肝脏不规则坏死和出血混杂、心肌出血、脾脏肿大斑块状坏死、肾脏和法氏囊出血为主要特征的新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus，NDRV)(鸭出血性坏死性肝炎)。

动物传染病确诊的传统方法主要通过病原的分离、电镜观察、血清学鉴定等方法，但该方法繁琐、费时，不利于疾病的早期诊断及快速控制。随着分子生物学的兴起，PCR、RT-PCR技术因具有特异性强、敏感性好、快速等优点已广泛用于动物病原微生物的检测，常见的动物传染病都已建立其相应的PCR或RT-PCR的检测方法。

2004年，胡奇林等人根据S1基因序列设计引物，建立了番鸭呼肠孤病毒的临床快速诊断方法，在此基础上，2011年王劭等人又为了鉴别诊断MDRV及NDRV，利用NDRV S3基因变异区作为RT-PCR诊断的靶区段设计引物，建立了检测NDRV的RT-PCR方法。但上述建立的RT-PCR方法是基于鉴别诊断而设计的，只能扩增出各自相应病毒的条带，单独检测MDRV或NDRV，无法建立番鸭呼肠孤病毒通用的RT-PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中的不足，提供了一种特异性强、敏感性高的番鸭呼肠孤病毒通用型RT-PCR检测引物。

一对引物，包括：

上游引物：5’-CACAGTGCTACCATC-3’；

下游引物：5’-CTGCTGATCATAATT-3’。

本发明还提供了一种包含所述引物的RT-PCR试剂盒。

本发明还提供了所述RT-PCR试剂盒在检测番鸭呼肠孤病毒中的应用。

本发明又提供了一种检测番鸭呼肠孤病毒的方法，利用待检测样品的RNA和所述的引物进行RT-PCR扩增，如果扩增产物包含436bp的片段，则待测样品包含番鸭呼肠孤病毒。

优选的，所述RT-PCR扩增的反应体系为：

无RNA酶的蒸馏水补足体系至25.0μL。

优选的，RT-PCR的反应条件为：

(1)50℃30min；

(2)预变性：95℃4min；

(3)变性：94℃45s；退火：56℃45s；延伸：72℃45s；共进行30次循环；

(4)延伸：72℃10min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明根据番鸭和鹅呼肠孤病毒分离株的σA基因(GenBank登录号为JX145335、KF154117和KF306091)，经过与GenBank登陆的相关序列进行比对后，优化设计了通用型引物，并利用该引物深入优化了一步法RT-PCR，最终实现了番鸭呼肠孤病毒(MDRV和NDRV)的快速检测。采用该引物及优化的RT-PCR方法不仅能够同时检测MDRV和NDRV两种番鸭呼肠孤病毒，而且还具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点。

附图说明

图1为一步法RT-PCR检测不同类型番鸭呼肠孤病毒的电泳图。

M.DL1000DNA Marker；1.ARV-00m；2.ARV-05m；3.ARV-03g；4.ARV-09m；5.ARV-HNF；6.阴性对照。

图2为一步法RT-PCR检测不同类型鸭病毒的电泳图。

M.DL1000DNA Marker；1.ARV-00m；2.ARV-03g；3.ARV-HNF；4.DTMUV；5.DEV；6.NDV；7.MDPV；8.DHAV；9.EDSV；10.H9N2。