[发明专利]通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的方法及培养基

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的方法及培养基。

背景技术

草莓属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本果树，在世界小浆果生产中居于首位，绝大部分国家均有栽培。种质资源是育种的物质基础,近代作物育种所取得的巨大成就主要得益于一批重要种质的发现和利用,以及育种技术的创新和应用。种质资源的收集、发掘和利用越来越受到各国政府和育种家的高度重视。一方面,由于人们对种质资源的重视,存在于植物本身的有利基因及性状越来越多地被发现,对其利用的速度也在加快。另一方面,种质资源的概念已经拓展,其研究利用的趋势是扩大亲缘距离进行远缘或超远缘杂交育种。

中国是世界上野生草莓资源种类最丰富的国家，全世界草莓属植物约有20个种，在我国自然分布的野生草莓有11个种，约占世界草莓资源的一半以上。野生草莓具有广泛的适应性和多种优良性状,是品种改良的重要亲本。在野生草莓中存在着大量可利用的优良性状,如抗病、抗逆、果实品质(大果、香味、硬肉等)、光周期(四季结果和日中性)、直立性及可观赏性等,将其导入草莓栽培种对草莓种质创新和品种改良极为重要。我国分布的野生草莓资源多为倍性较低的2x、4x和5x,在与8x栽培草莓杂交时常出现不亲和或杂种不育等现象。中国在野生草莓的远缘杂交利用方面已经取得了重要进展,主要利用栽培种凤梨草莓与野生草莓常规杂交，通过染色体加倍获得了一批多倍性中间育种材料。但染色体加倍技术复杂，成本较高，果实发育迟缓，结实率偏低，不易获得目标性状材料，育种年限长。

远缘杂交是利用外源基因获得优良种质的一条很好途径,但杂交常常会碰到很多障碍,其中胚胎发育中途夭折就是其一,即远缘杂交授粉、受精成功,受精卵也可分裂,早期胚胎可以发育,但胚胎发育到一定时间就停止、死亡。通过离体胚挽救技术在胚败育前,取杂种胚培养可以克服这种障碍。胚挽救技术是育种研究中克服胚败育或发育不良,提高萌发率以及提早萌发,缩短童期、培育远缘杂交优良种质的有效手段。Wang D等人报道了草莓幼胚培养的研究，但主要是针对幼胚培养的影响因素进行了研究，并未研究在育种技术中的具体应用(HortScience，1984，19：71-72)。由于远缘杂交育种过程中选择的亲本来源和遗传背景不同，在对未成熟胚进行离体培养过程中胚诱导、胚萌发、增殖、生根、成苗等状况会存在差异性，目前利用草莓的未成熟胚进行离体培养在远缘杂交育种中的成功应用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的方法及培养基，采用离体胚挽救技术，将野生品种和栽培品种进行远缘杂交获得的幼胚取出并进行离体培养,使其在离体条件下发育成为正常植株，能够获得丰富的中间性育种材料,可以缩短育种年限,节约人力物力,较快地获得优良种质。

为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：

通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的方法，包括以下步骤：

1)杂交授粉：以栽培草莓品种和野生草莓品种为杂交亲本进行杂交授粉；

2)果实消毒：将授粉后5～35天的果实取下，4℃～7℃存放3～4小时，选取大小为1～3厘米的果实，先用70％的酒精表面消毒10秒，再在0.1wt％的升汞溶液中灭菌1～3分钟，用无菌水清洗3～5遍，吸干表面水分；

3)未成熟胚剥离：在无菌条件下，将灭菌的果实取下种子剥离其幼胚，立即接种于诱导培养基中离体培养，先暗培养7天，再进行光照培养，诱导培养21～28天后获得膨大的胚；

光照培养条件为：光照时间10小时/天，光照强度2000～3000Lx，培养温度24±1℃；

诱导培养基：1/2MS基本培养基，蔗糖30～50g/L，琼脂6～8g/L，吲哚丁酸IBA 0.3～0.5mg/L，pH5.5～5.8；

4).胚萌发培养：将膨大的胚剥除胚乳后置于胚萌发培养基中进行挽救培养，培养30～35天后幼胚萌发，光照培养条件同步骤3)；

胚萌发培养基：1/2MS基本培养基，蔗糖30～50g/L，琼脂6～8g/L，萘乙酸NAA 0.2～0.5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤6-BA 1.2～1.5mg/L，pH5.5～5.8；

5)增殖培养：将萌发的幼胚接种至增殖培养基中，光照培养条件与培养基组成同步骤4)，每10-15天继代增殖1次，获得芽苗；

6).生根培养：将经过1～4次继代增殖培养的芽苗从芽丛中切下，转到生根培养基中促使其生根，生根培养45～60天，得到生根的草莓胚苗，培养温度24±1℃；