[发明专利]多形汉逊酵母重组菌株及其在紫杉醇生物合成中的应用

说明书

技术领域

本发明属于通过遗传转化获得产紫杉醇的转基因酵母重组菌领域，具体涉及利用低能离子注入介导红豆杉基因组总DNA在酵母菌中遗传转化获得的多形汉逊酵母重组菌株及其在紫杉醇生物合成中的应用。

背景技术

紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxo1)是当今世界公认的广谱、疗效确切的天然抗癌药物，其分子结构是由浆果赤霉素Ⅲ(baccatinⅢ)以及连接在13位碳上的苯丙氨酸衍生物构成的三环二萜类生物碱。紫杉醇是目前人们所了解的唯一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物，细胞接触紫杉醇后在细胞内积累大量的微管，而这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，从而阻断了细胞的正常分裂。1992年，美国食品药品管理局(FDA)正式批准紫杉醇上市，用于治疗卵巢癌和乳腺癌。此后，临床上相继发现紫杉醇对结肠癌、直肠癌、膀胱癌、转移性乳腺癌，以及对肺癌、恶性黑色素癌和肉瘤等均表现出一定疗效，紫杉醇已成为国际抗肿瘤的主流药物之一。

目前，紫杉醇主要是通过从红豆杉原料中提取紫杉醇或其中间体的方法获得。值得注意的是，红豆杉成树一般需要100-250年，加之紫杉醇在树皮中的含量较低(平均含量约0.015％)，生产1kg紫杉醇大概需要7000kg，相当于2000-2500棵成年红豆杉。由于临床上对紫杉醇的需求量日益增加，导致对红豆杉过度开发，致使天然红豆杉面临匮乏与枯竭，加之引种驯化困难、人工栽培周期长、活性组分产量低，使得传统的从红豆杉植株中直接提取紫杉醇的方式受到极大的限制和挑战。

因此，红豆杉属植物的资源问题已经引起各国环保专家和政府的高度重视，我国已将红豆杉列为一级珍稀濒危，相当于“植物中的大熊猫”，严禁砍伐。另外，紫杉醇的分子结构十分复杂，分子中有众多的功能基团和立体化学特征。尽管早在1994年紫杉醇的全化学合成就获得了成功，但是由于其反应步骤多，需大量使用手性试剂，反应条件极难控制，制备成本十分昂贵，难以适合大规模工业生产。

现代微生物发酵技术因其在寻求紫杉醇新型药源方面具有独特优势，逐渐成为当今国际生药学界的研究热点之一。然而，目前紫杉醇生物合成途径及其相关基因尚未阐明清楚。

近年来，在植物天然产物生物合成基因信息及生物合成途径尚未阐明前，Lü等通过Ar⁺和N⁺注入介导麻黄基因组DNA转化酵母，获得遗传稳定酵母工程菌，麻黄碱和伪麻黄碱产量分别为18.85mg/L和4.11mg/L。Jin等利用低能离子注入介导甘草基因组DNA转化酵母，获得了遗传稳定的酵母工程菌，其五环三萜苷类物质甘草酸的最高产量达114.49mg/L。

目前，国外尚未见利用低能离子注入介导药用植物基因组DNA转化酵母技术构建产药用有效成分的重组菌的研究报道，在遗传改造酵母生物合成紫杉醇方面国内外都尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多形汉逊酵母重组菌株及其在紫杉醇生物合成中的应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。

一种多形汉逊酵母重组菌株，该重组菌株的分类命名为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，所述重组菌株保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.8999。

所述重组菌株的筛选方法包括以下步骤：

1)运用低能离子注入介导红豆杉基因组DNA转化多形汉逊酵母出发菌株；

2)重组菌株初筛：将经过步骤1)处理后的出发菌株涂布于YPD固体培养基进行培养，挑取新鲜菌落进行液体培养发酵后，采用香草醛反应和FeCl₃试验对重组菌株的发酵液进行分析，鉴定发酵液中是否存在紫杉醇；

3)将经过定性方法初筛得到的重组菌株进一步发酵培养，利用薄层层析和高效液相色谱对其发酵液进行分析，进一步筛选鉴定重组菌株。

所述出发菌株为多形汉逊酵母H.polymorpha DL-1(来源为ATCCNo.26012)。

所述低能离子注入采用低能N+作为注入离子，最佳注入剂量为1.5×10¹⁶～2.5×10¹⁶ions/cm²，最佳注入能量为15～25KeV，脉冲时间为5～10s，间隔时间为5～10s，真空度为1.5～2.0×10^-3Pa。

所述重组菌株的发酵方法包括以下步骤：于37℃、转速为200r/min下培养72～120h。