[发明专利]多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用

说明书

技术领域

本发明属于通过遗传转化获得产龙胆苦苷的转基因酵母重组菌领域，具体涉及利用离子注入介导秦艽总DNA在酵母菌中遗传转化获得的多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用。

背景技术

龙胆苦苷(Gentiopicroside)，别名龙胆苦甙，分子式为C₁₆H₂₀O₉，分子量为356.11，为裂环环烯萜苷类化合物，属于倍半萜类物质，是药用植物秦艽(Gentiana macrophylla)的主要药用成分。近年来的研究表明，龙胆苦苷具有镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利胆、健胃抗溃疡等作用，如作为国家一类新药注射用秦龙苦素，为秦艽提取物龙胆苦苷的冻干粉针，用于黄疸型病毒性肝炎治疗。

龙胆苦苷多来源于龙胆科多年生草本植物秦艽。秦艽为龙胆科、龙胆属多年生草本植物，是我国重要的中药材之一。秦艽生长在高海拔地区，生长周期长，易受季节变化影响。近年来因秦艽具有很高的药用价值，过渡采挖使野生秦艽资源出现严重匮乏，加上秦艽人工栽培存活率低的问题，导致龙胆苦苷的供应量难以满足临床需求。因此，迫切需要寻求及扩大龙胆苦苷新药源途经以满足临床上对其日益增长的需求。

目前，Tiwari等运用发根农杆菌诱导出秦艽毛状根，但其不能生产龙胆苦苷。此外，齐香君等运用药源植物秦艽细胞生产龙胆苦苷，其龙胆苦苷产量仅为0.242mg/g，而且其发酵周期长。上述研究目前都未能获得理想的结果。在秦艽资源开发研究方面，国外尚未报道。因此，亟需寻求新的研究思路解决龙胆苦苷来源短缺问题。

近年来，分离天然产物生物合成基因，并借助酵母细胞工厂大量而经济地生物合成植物天然产物成为有效途径之一。然而，植物萜类化合物，如单萜、倍半萜以及双萜等高级萜类不仅拥有特异的合成途径，且具有独特的酶促反应机制。同时，许多已知代谢途径不能作为参考，植物次生代谢网络多且复杂，加上部分关键代谢酶基因处于低表达水平，很难从蛋白分子水平获得表达。

近年来，在植物天然产物生物合成基因信息及生物合成途径尚未阐明前，Lü等通过Ar+和N+注入介导麻黄基因组DNA转化酵母，获得遗传稳定酵母工程菌，麻黄碱和伪麻黄碱产量分别为18.85mg/L和4.11mg/L。Jin等利用低能离子注入介导甘草基因组DNA转化酵母，获得了遗传稳定的酵母工程菌，其五环三萜苷类物质甘草酸的最高产量达114.49mg/L。同时，由于酵母自身存在甲羟戊酸(Mevalonate，即MVA)途径，可自我合成萜类物质前体异戊二烯焦磷酸，这为利用微生物合成萜类化合物龙胆苦苷提供了一个很好的基础平台。目前，国外尚未见利用低能离子注入介导药用植物基因组DNA转化酵母技术构建产药用有效成分的重组菌的研究报道。具体在遗传改造酵母生物合成龙胆苦苷的方面，国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。

一种多形汉逊酵母重组菌株，该重组菌株的分类命名为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，所述重组菌株保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.8998。

所述重组菌株的筛选方法，包括以下步骤：

1)运用低能离子注入介导秦艽基因组DNA转化多形汉逊酵母出发菌株；

2)重组菌株初筛：挑取在YPD固体培养基中培养的经过步骤1)处理后的出发菌株的菌落进行YPD液体发酵，离心取发酵液，采用Molish反应和Fehling试验对重组菌株的发酵液进行分析，初步定性分析发酵液中是否存在龙胆苦苷；

3)将经过定性方法初筛得到的重组菌株进一步进行YPD液体发酵培养，利用薄层层析和高效液相色谱分析发酵所得发酵液，从而对重组菌株进一步筛选鉴定。

所述出发菌株为多形汉逊酵母H.polymorpha DL-1(来源为ATCCNo.26012)。

所述低能离子注入的条件为：注入离子为N+，注入剂量为1.5×10¹⁶～2.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量为15～25KeV，脉冲时间为5～10s，间隔时间为5～10s，真空度为1.5～2.0×10^-3Pa。

所述重组菌株的发酵方法包括以下步骤：于37℃、转速为300r/min条件下培养60～96h。