[发明专利]一种不整合可删除新型非病毒载体及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种不整合非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体包含S/MAR序列、SV40复制原点和Cre-ERT2表达序列，所述的S/MAR序列的上游和下游分别具有一个loxP序列，两个loxP方向相同，且其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。

2.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体还包括外源目的基因，优选的为EGFP。

3.根据权利要求2所述的非病毒载体，其特征在于，所述的S/MAR序列、Cre-ERT2表达序列和外源目的基因共用启动子和终止子，所述的启动子优选为真核表达的启动子。

4.根据权利要求3所述的非病毒载体，其特征在于，所述的Cre-ERT2表达序列与外源目的基因用IRES序列连接。

5.根据权利要求3所述的非病毒载体，其特征在于，一个LoxP序列在所述启动子上游连接，另一loxP序列在S/MAR序列的下游连接。

6.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的S/MAR序列如SEQ ID NO.6所示，所述的SV40复制原点的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的Cre-ERT2表达序列如SEQ ID NO.2所示，所述的loxP序列与SEQ ID NO.8有85%-100%相似度，优选的LoxP序列如SEQ ID NO.8所示。

7.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，它是通过以下方法构建的：

a）从序列如SEQ ID NO.1所示的pEP4-Cre-EGFP质粒中克隆出Cre-ERT2-IRES-EGFP片段，

b）将Cre-ERT2-IRES-EGFP片段插入pcDNA3.1(-)质粒的CMV Promoter下游，得到pcDNA-Cre-EGFP质粒，

c）用EF1α Promoter替换pcDNA-Cre-EGFP中的CMV Promoter得到pECG质粒，

d）将S/MAR片段插入到pECG载体中，得到pECG-S/MAR质粒，

e）利用SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示的引物以pECG-S/MAR质粒为模板克隆出Afl II-LoxP片段，

f）将pECG-S/MAR质粒和Afl II-LoxP片段用Afl II和Xma I双酶切，分别得到pECG-S/MAR载体和Afl II-LoxP-XmaI片段，

g）将Afl II-LoxP-Xma I片段插入到pECG-S/MAR载体中，得到pECG-S/MAR-Afl IILoxP质粒，

h）用与步骤g）同样的方法将另一个loxP插入到pECG-S/MAR-Afl IILoxP质粒的EF1α promoter 5’端，得到pECG-S/MAR-LoxP。

8.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体还具有药物筛选标记基因和/或实时筛选标记基因。

9.一种权利要求1所述的非病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将S/MAR序列、SV40复制原点、Cre-ERT2表达序列构建于骨架载体中，并于所述的S/MAR序列的上游和下游各插入一个loxP序列，同时保证其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。

10.权利要求1-9任一所述的非病毒载体的用途，其特征在于，用于介导外源目的基因进入宿主细胞并在宿主细胞中表达。