[发明专利]一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法。

背景技术

埃博霉素(epothilones)是微生物粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一类16元大环内酯次级代谢产物，具有微管蛋白聚合和微管稳定的作用，具体作用机制为促进GTP依赖性微管蛋白聚合形成微管和稳定微管；通过稳定微管组装过程抑制微管解聚，导致微管束排列异常，形成星状体，从而抑制细胞形成正常的纺缍体，干扰肿瘤细胞的生长，甚至诱导其死亡。最近研究表明，天然埃博霉素的活性比紫杉醇强10到1000多倍,对紫杉醇及其它抗癌药物有耐药性的癌细胞也具有非常高的活性；水溶性比紫杉醇更好，注射口服均可，结构简单，且具有较强的耐药性便于配制和使用,因此埃博霉素作为极具潜力的抗癌新药，引起了全世界的化学家，生物学家及药学家的极大兴趣和研究热情。目前已有一个埃博霉素药物(BMS-247550，Ixabepilone，用于卵巢癌的治疗)投放市场，另外至少还有六个埃博霉素药物(ABJ-879，Patupilone,BMS-310705,KOS-862，KOS-1584和ZK-EPO)在进行临床研究。埃博霉素有望成为取代紫杉醇的更为有效的抗肿瘤药物。现在发酵埃博霉素大都依靠在发酵液中添加大孔吸附树脂来进行提取分离，然而树脂对营养物质的非特异性吸附，给发酵过程中的优化和控制带来新的难题。

分子印迹膜(MIM)的研究最早开始于20世纪90年代，有报道通过光聚合的方法在溶剂中将3’,5’-环腺苷酸分子印迹膜接枝到聚偏氟乙烯超滤膜表面，制备出了对3’,5’-环腺苷酸分子具有识别特性的分子印迹复合膜。这种将MIPs对特定印迹分子的专一识别性与膜分离的操作简单、易于连续化、条件温和等特点结合起来，制备对特定印迹分子具有高选择性、大通量的分子印迹复合膜。分子印迹膜兼具有分子印迹和膜的特点，不需要研磨等制备过程，克服了膜技术中无法实现特定物质选择性分离的特点，实现了特异地将目标分子从混合物中分离纯化的目的。它将膜分离的可连续化操作特点与分子印迹技术进行了结合，是最有应用前景的一种膜分离技术。

目前还没有分子印迹膜应用于埃博霉素B的原位分离的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，所制备的埃博霉素B提高发酵产量；同时利用分子印迹膜专一分离埃博霉素，而不分离其它成分来降低下游分离纯化成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)前期发酵

菌种活化：将一支纤维堆囊菌接种到CNST培养基上活化，在培养基上放置灭菌的滤纸片，然后将放置有滤纸片的CNST培养基置于恒温培养箱中于28～32℃下培养5～7d；

种子培养：用接种环从CNST培养基上刮取降解了滤纸片的黄色菌落，接种到含有种子培养基的种子瓶中，置于巡回式摇床上，于28～32℃下培养2～3d，得到种子培养液；

(2)发酵培养：按每100mL接种5～10mL的比例将种子培养液接种于发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为28～32℃，搅拌转速为100～150r/min，通气量为2.5～4.5L/min；

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：待纤维堆囊菌在发酵罐中发酵72～120h后，将发酵罐中的发酵液持续通入到装有分子印迹膜的第一过滤装置中，进行过滤以分离出埃博霉素B，除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中继续发酵；

(4)补料：在发酵过程中，将灭菌的新鲜培养基加入到发酵罐中；

(5)埃博霉素B洗脱分离：发酵96～144h之后，对第一分离装置中分离出的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液，同时将发酵罐中的发酵液通入到装有分子印迹膜的第二过滤装置中，进行过滤以分离出埃博霉素B，除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中继续发酵；发酵120～168h后对第二分离装置中分离出的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液；整个发酵过程将发酵罐中的发酵液交替通入到第一分离装置和第二分离装置中，待发酵罐中的发酵液发酵15d后，停止发酵，最后合并收集的洗脱液，浓缩得到埃博霉素B。