[发明专利]一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法

权利要求书

1.一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)前期发酵

菌种活化：将一支纤维堆囊菌接种到CNST培养基上活化，在培养基上放置灭菌的滤纸片，然后将放置有滤纸片的CNST培养基置于恒温培养箱中于28～32℃下培养5～7d；

种子培养：用接种环从CNST培养基上刮取降解了滤纸片的黄色菌落，接种到含有种子培养基的种子瓶中，置于巡回式摇床上，于28～32℃下培养2～3d，得到种子培养液；

(2)发酵培养：按每100mL接种5～10mL的比例将种子培养液接种于发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为28～32℃，搅拌转速为100～150r/min，通气量为2.5～4.5L/min；

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：待纤维堆囊菌在发酵罐中发酵72～120h后，将发酵罐中的发酵液持续通入到装有分子印迹膜的第一过滤装置中，进行过滤以分离出埃博霉素B，除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中继续发酵；

(4)补料：在发酵过程中，将灭菌的新鲜培养基加入到发酵罐中；

(5)埃博霉素B洗脱分离：发酵96～144h之后，对第一分离装置中分离出的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液，同时将发酵罐中的发酵液通入到装有分子印迹膜的第二过滤装置中，进行过滤以分离出埃博霉素B，除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中继续发酵；发酵120～168h后对第二分离装置中分离出的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液；整个发酵过程将发酵罐中的发酵液交替通入到第一分离装置和第二分离装置中，待发酵罐中的发酵液发酵15d后，停止发酵，最后合并收集的洗脱液，浓缩得到埃博霉素B。

2.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述CNST培养基的pH值为7.2～7.5，并于121℃下灭菌30min；CNST培养基中KNO₃为0.3～0.5g/L，Na₂HPO₄为0.25～0.30g/L，MgSO₄·7H₂O为1.0～1.5g/L，EDTA-Fe³⁺溶液为1～1.5mL/L，微量元素液浓度为1～1.5mL/L，琼脂为20～25g/L。

3.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述种子培养基的pH值为7.2～7.5，并于115℃下灭菌30min；种子培养基中土豆淀粉为7～9g/L、豆蛋白胨为2～3g/L、葡萄糖为2～3g/L、酵母粉为2～3g/L、MgSO₄为2～5g/L、CaCl₂为2～5g/L、EDTA-Fe³⁺溶液浓度为1～1.5mL/L。

4.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述分子印迹膜的制备方法如下：

以聚砜中空纤维超滤膜为基膜，埃博霉素为模板分子，甲基丙烯酸甲酯为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，甲醇为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用表面热聚合方法制备分子印迹膜。

5.如权利要求4所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，分子印迹膜具体的制备过程为：

将10mmol的埃博霉素溶解于50mL甲醇-水的混合溶液中静置30min，加入40mmolα-甲基丙烯酰胺、200mmol季戊四醇三丙烯酸酯，振荡溶解10min，再加入60mg偶氮二异丁腈，超声脱气，反复冲入高纯氮气脱氧，保持惰性环境，以聚砜中空纤维超滤膜为基膜，在65℃下表面聚合48h，得到含模板分子的印迹膜；利用乙酸-甲醇-水的混合溶液做洗脱液，抽提24h，然后用体积比为4：1的甲醇、水的混合溶液反复洗脱掉模板分子，60℃恒温真空干燥24h，得到埃博霉素B的分子印迹膜；其中，甲醇与水的混合溶液中，甲醇与水的体积比为1:4；乙酸-甲醇-水的混合溶液中乙酸、甲醇、水的体积比为1：20：10。