[发明专利]一种角蛋白酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶基因功能改造技术领域，具体涉及一种角蛋白酶突变体及其应用。

技术背景

角蛋白(keratinase)是一种广泛存在于自然界中的硬性蛋白，主要存在于动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等结构中。角蛋白的肽链是以α-螺旋和β-片层结构组成的，通过二硫键、氢键和其他交联键作用形成非常稳定的高度交联的三维结构，不溶于水，不能被一般的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解。但角蛋白营养丰富，例如羽毛中含粗蛋白80％以上，含各种氨基酸总量70％以上，并且含多种动物所需要的必需氨基酸，若加以妥善处理，是一种良好的饲料蛋白来源。且随着现代家禽养殖规模化生产，产生了大量角蛋白类废物，如不及时处理，将造成局部环境的严重污染，而自然界中某些微生物可利用自身分泌的角蛋白酶将其分解利用，作为生长所需的碳源和氮源。

角蛋白酶是一种特异性降解角蛋白的酶类，可由多种微生物产生，它能将角蛋白水解成游离的氨基酸或多肽。目前普遍认为角蛋白酶的降解过程分三个步骤，即变性作用、水解作用和转氨基作用。首先二硫键还原酶作用于角蛋白二硫键，将胱氨酸(-S-S-)还原为半胱氨酸(-SH)，使角蛋白高级结构阶梯而形成变性角蛋白；变性角蛋白在多肽水解酶作用下逐渐水解成多肽、寡肽和游离氨基酸；最后由转氨基作用产生氨气和硫化物而使角蛋白彻底水解。角蛋白酶的这种特性，可用于处理废弃的动物羽毛、毛发等，并将这些原来污染环境的物质变废为宝，使其在饲料工业、医药工业、食品工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。因此，通过筛选或改造的方法获得性能优良的角蛋白酶成为本领域内的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种角蛋白酶突变体及其应用，本发明通过对来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的角蛋白酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，使其耐热性得到显著提高，pH作用范围扩大，有利于其广泛应用。

申请人对枯草芽孢杆菌角蛋白酶的N末端进行突变，经过大量的筛选，发现S13N，S27N和Q46K这三个突变位点能引起角蛋白酶耐碱性和耐热性的改变，从而促成本发明。

本发明一方面提供了一种角蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第13位氨基酸由Ser变为Asn，第27位氨基酸由Ser变为Asn，第46位氨基酸由Gln变为Lys。

上述角蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明一方面提供了携带有上述角蛋白酶突变体编码基因的重组质粒。

本发明另一方面提供了携带有上述重组质粒的枯草芽孢杆菌重组菌株。

本发明还提供了上述角蛋白酶突变体在饲料中的应用。

本发明提供的角蛋白酶突变体最适作用pH值为7.0，在碱性条件下的相对酶活水平均高于野生型，耐碱性更强；其最适作用温度为50℃，在45℃-60℃范围内，能保持60％以上的相对酶活，在65℃条件下处理5min后能保持85％以上的酶活，在70℃条件下处理5min后仍能保持55％以上的酶活，与野生型相比耐热性得到较大提升。此外，本发明的角蛋白酶突变体对饲用蛋白原料的酶解效果显著高于野生型，因此更有利于提高养殖动物对饲料中蛋白原料的利用率，进而可以减少蛋白原料的添加量，降低饲料成本，增加经济效益。

附图说明

图1：本发明角蛋白酶突变体Ker7与野生型KerI作用pH-相对酶活曲线图；

图2：本发明角蛋白酶突变体Ker7与野生型KerI pH稳定性比较图；

图3：本发明角蛋白酶突变体Ker7与野生型KerI作用温度-相对酶活曲线图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1角蛋白酶基因突变库的构建