[发明专利]一种采用重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法

权利要求书

1.一种采用重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，该检测方法包括疟原虫DNA提取、含有疟原虫属通用引物的重组酶介导等温核酸扩增体系和反应缓冲液，扩增在等温条件35-42℃下进行，5-60分钟内即可检测出疟原虫。

2.根据权利要求1所述的重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，其特征在于，所述含有疟原虫属通用引物的重组酶介导等温核酸扩增体系为：Tris缓冲液、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、肌酸激酶、SSB蛋白、RecQ蛋白、UvsY蛋白、UvsX蛋白、DNA聚合酶和疟疾通用引物组。

3.根据权利要求1、2所述的重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，其特征在于，所述含有疟原虫属通用引物的重组酶介导等温核酸扩增体系各组分含量为：

将上述扩增体系，在-20℃条件下，负压冷冻干燥20小时，成为粉末状扩增体系。

4.根据权利要求1所述的重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，其特征在于，所述的反应缓冲液为浓度为6％(w/v)的，分子量为20000的聚乙二醇水溶液。

5.根据权利要求1、2、3所述的重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，其特征在于，所述的引物为疟原虫属通用引物，包括正向引物和反向引物。

6.根据权利要求5所述的疟原虫属通用引物，其特征在于，所述引物序列为：

正向引物序列：5’-CCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTG-3’，

反向引物序列：5’-CTCGCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTC-3’。

7.根据权利要求1、2、3所述的重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，其特征在于，含有疟原虫属通用引物的重组酶介导等温核酸扩增体系为冷冻干燥后的粉末状，扩增时用浓度为6％(w/v)的，分子量为20000的聚乙二醇作为反应缓冲液将体系重新溶解成为25μl、50μl、100μl中的任一个体积进行扩增，其最佳扩增体积为50μl。

8.根据权利要求1所述的重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，其特征在于，扩增的最佳等温条件为37℃。

9.根据权利要求1所述的重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，其特征在于，扩增的最佳时间为30分钟。

10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7所述的重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法，其特征在于，将含有疟原虫属通用引物的重组酶介导等温核酸扩增体系用反应缓冲液溶解到最佳体积50μl，加入提取的疟原虫DNA1μl，放入37℃恒温水浴扩增30分钟后，加入50μL酚氯仿(1∶1)，振荡，12000rpm离心5分钟，吸取10μL上清液加到琼脂糖凝胶上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外投射仪下观察扩增产物，阳性样品在分子量186bp位置出现DNA扩增条带。