[发明专利]一种新型核酸染料的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种新型核酸染料的制备及其应用，以用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中核酸的染色。

背景技术

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应、浓缩效应、电荷效应，对于小片段DNA(5bp-500bp)的分离效果最好。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段但，其分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳，而且进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵以及交联剂N,N’-亚甲双丙烯酰胺之间的化学反应而形成。丙烯酰胺单体在催化剂作用下产生聚合反应形成长链，长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度，调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比例，可改变聚合物的交联度。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，可分离只相差1个核苷酸的DNA片段。

相比于琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶是密集程度更高的三维空间的高聚物，这种高密集聚合物结构，使得在分离不同大小范围、不同浓度范围的的核酸分子时，作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色效果不佳。原有的部分核酸染料也可以用于染色聚丙烯酰胺凝胶中的DNA，例如美国Biotium.Inc.生产的Gel Red/Gel Green，美国Life Technologies公司的SYBR Safe以及通常用的Ethidium Bromide，但是都存在染色效果不佳，或者核酸染料本身具有高毒性、高危害性，比如：Gel Red/Gel Green独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果也表明，该染料的诱变性远远小于EB，但Gel Red/Gel Green的大分子量特点使其在难以穿透细胞膜的同时也难以渗透高密集的聚丙烯酰胺凝胶，因而存在染色效果不佳的缺陷；SYBR Safe的诱变性比EB要低的多，但检测灵敏性较低。

综上所述，现有技术存在两大问题：

第一个是因为聚丙烯酰胺凝胶是密集程度更高的三维空间的高聚物，这种高密集聚合物结构，使得在分离不同大小范围、不同浓度范围的核酸分子时，现有的多种作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色效果不佳，因此，需要从分子结构上做改进，从而使小分子的荧光染料可以更容易的渗透到这种高密集程度的高聚物中；

第二个问题是，现有的多种核酸染料本身具有高毒性、高危害性，因为这些核酸染料可以穿透细胞膜，从而和细胞里面的DNA分子结合，导致产生基因突变，具有强致癌性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种新型核酸染料的制备方法与应用，以获得具有染色性能好、毒性低的核酸染料用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种新型核酸染料，其结构通式如下：

其中R^-为碘负离子；

其中，R₁、R₂、R₃为小于六个碳的烷基；

n的取值范围为2-6；

R₄为磺酸基，为在菲啶6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。

其中，所述R₁、R₂、R₃为C1-C4的烷基；优选的，所述R₁为C1-C3的烷基、R₂与R₃为C2-C4的烷基；优选的，所述R₁为甲基，所述R₂与R₃为乙基。

其中，所述n的取值范围为2-4；优选的，所述n＝3。

本发明又提供了一种上述新型核酸染料的制备方法，包括如下步骤：

1)：由原料3,8-二氨基-6-苯基菲啶在体系中反应获得中间体I，即：