[发明专利]一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于化脓隐秘杆菌检测技术领域，涉及一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法。

背景技术

化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,A.pyogenes)是一种多形性、无运动性的革兰氏阳性杆菌,曾经被认为是化脓棒状杆菌,而后被分类到放线菌属。Ramos根据16S rRNA基因进行系统进化分析后将其重新分类到隐秘杆菌属。化脓隐秘杆菌常寄生于上呼吸道、消化道等黏膜处，是一种条件性致病菌，能引起多种动物如猪、牛、羊、禽和人类的多种器官、黏膜的化脓性感染，如肺炎、乳房炎、子宫内膜炎、关节炎、外耳炎、膀胱炎及肝脏、肾脏脓肿等症状。唐婕等报道了化脓隐秘杆感染林麝可引起其颌下、鼻镜等处的脓肿。且与大肠杆菌、链球菌等混合存在，使感染加重，可导致麝的死亡，给麝养殖业带来较大的经济损失。

已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子主要有溶血素(PLO)、神经氨酸酶(Nan)、胶原结蛋白(CbpA)及菌毛合成蛋白(Fim),其最主要的致病因子是细胞外毒素溶血素Pyolysin（PLO）。1997年,Billington等从野生型化脓隐秘杆菌BBR1中克隆了PLO全基因,并测定其核苷酸序列。

目前，化脓隐秘杆菌诊断技术主要有传统的细菌生化鉴定和PCR方法。传统细菌培养及生化鉴定需较长的时间，PCR检测需进行电泳及PCR仪等仪器，不便于目前野外临床快速的检测。

2000年，Notomi等开发了环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP），其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在约62℃进行等温扩增。该方法具有灵敏度高，特异性好，反应时间短，判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，广泛应用于病毒、细菌、寄生虫的诊断。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物及检测方法，从而能够对化脓隐秘杆菌进行特异性强、灵敏度高的快速检测，而且还能够适用于野外临床样品的可视化检测。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物，包括以下3对引物：F3和B3、FIP和BIP1μL、FLP和BLP；其核苷酸序列分别为：

FIP：ttgcctccag ttgacgctta atagcaagta tcctgaccat g；

BIP：aaggtctcag ccaagctcaa cgaaggaagc gatagccac；

F3：taaggtcgtc atcaacaatc c；

B3：tatgtggaga tgtcggtgta；

LoopF：cgtcaccata gtctcatcgt ag；

LoopB：acttcgatgc aattcataag cg。

一种基于权利要求1所述化脓隐秘杆菌LAMP检测用引物的试剂盒，包括：

10×Thermopol buffer2.5μL、5μM的F3和B3各1μL、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的FLP和BLP各1μL、10mM的dNTPs4μL、5M的甜菜碱5μL、100mM的MgSO₄1μL、8U/μL的Bst DNA polymerase1μL、2μLDNA模板和3.5μL ddH₂O；共计25μL。

一种化脓隐秘杆菌LAMP检测方法，包括以下操作：

1）提取待检测对象的DNA模板；

2）将以下组份进行混合，构建25μL的LAMP反应体系：

10×Thermopol buffer2.5μL、5μM的F3和B3各1μL、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的FLP和BLP各1μL、10mM的dNTPs4μL、5M的甜菜碱5μL、100mM的MgSO41μL、8U/μL的Bst DNA polymerase1μL、2μL DNA模板和3.5μL ddH₂O；

F3和B3、FIP和BIP1μL、FLP和BLP的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.1～6所示；

3）将LAMP反应体系在63℃恒温反应60min，然后85℃加热2min，反应完成；

4）待反应完成后通过以下两种方式进行结果的判定：