[发明专利]一种肿瘤抑制多肽及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高效抑制血管生成多肽、其制备方法及用途。

背景技术

研究表明肿瘤组织的最大的一个特点为具有丰富的血管生成，即从宿主引发的新的毛细管内皮细胞的形成和转移是肿瘤生长和转移的必备条件。新生血管一方面给肿瘤提供了其恶性增长所需的营养，另一方面给肿瘤向远处转移提供了途径。如果在肿瘤形成过程中能抑制其血管内皮细胞的生成和迁移，就可以阻止肿瘤的生长和转移。因此抑制肿瘤血管生成是肿瘤治疗中日渐引起重视的一类药物，继血管抑素（angiostatin）和内皮抑素（endostatin）这两种已进入美国临床试验的药物之后，Tumstatin是近年来发现的一种能够抑制新生血管生成的蛋白药物。Tumstatin是胶原alpha3(IV)的NC1结构域，由245个氨基酸组成，具有抑制肿瘤新生血管生成和抑制肿瘤的生长和转移作用，这两种抗肿瘤的特性与一种非RGD依赖性的ITGB3介导的机制密切相关。Tumstatin经由与内皮细胞膜上的整合素alpha v beta3结合而抑制FAK（focal adhesion kinase）的磷酸化而进一步抑制PI3-K/Akt/mTOR/4EBP1信号转导通路的活化，从而抑制内皮细胞蛋白质的合成，进而抑制内皮细胞的增殖，最终抑制肿瘤新生血管生长及肿瘤的生长和转移（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003，100:4766-4771）。

最近,小鼠黑色素瘤模型的药理实验（J Biol Chem.2004，279(3):2091-100）证明Tumstatin的NC1(IV)N端7个氨基酸185-191(CNYYSNS)组成的肽也具有同样的抗肿瘤生长的特性,其在三维结构上共同的特征是YSNS序列呈beta-转角构象，这种构象是维持其生物活性的至关重要的条件。

组织穿入是向细胞递送药物的严重限制之一，如何有效地把药物内化至细胞内是药物传输中的一个重要课题。目前为止，发现了两种类型的细胞穿入肽（cell-penetring peptide），一类是疏水性的，一类是阳离子型的（Adv Drug Deliv Rev2005，57,529-45）。Tat是其中一种可以把核酸和蛋白质引入细胞的阳离子型肽（Nat Med2007，12,327-78；Trends cell Biol1998；8,84-7）。并且在体内外的实验中，TAT与多肽结合后确实显示了其可将药物内化至细胞内的辅助作用，从而增强了目的药物的效果（Mol Ther.2009，17(9):1509-16.）。因此，TAT序列可以作为一种载体，将抗肿瘤多肽转运如细胞内部，最大程度的发挥抗肿瘤多肽的效果。故联合应用细胞穿入肽和抗肿瘤多肽的研究更有意义。

发明内容

本发明将抑制血管生成的tumstatin活性片段氨基酸序列（185-191）（Tumstatin-7），在其羧基端连接具有细胞穿越性的反式激活蛋白TAT(trans-activator protein)的第47位到第57位氨基酸残基组成的肽段序列，构建了一种具有细胞内化作用的血管生成抑制剂Tumstatin-7-TAT。本发明多肽序列为SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。它具有不同的理化性质，等电点由融合前的5.52变为11.40，水溶性也大大增加，从而减少有机性增溶溶媒的使用，而避免在临床使用中引起的不良反应。

本发明还公开了所述血管生成抑制剂的制备方法，包括：

（1）依据本发明所述具有抑制血管生成作用的多肽序列，按常规方法设计得到相应的基因序列；

（2）将上述人工合成的基因与原核载体进行重组，转化至大肠杆菌，乳糖诱导表达包含本发明所述具有抑制血管生成的多肽Tumstatin-7-TAT；表达产物以胞内可溶表达形式存在；

（3）收集破碎后的菌体上清，进行金属螯合亲和层析，肠激酶酶切，收集穿过液，冻干。

本发明所述的血管生成抑制剂还也可用多肽合成方法制备。

体内及体外活性药效试验显示，本发明的多肽具有抑制人脐静脉内皮细胞的迁移和抑制人肝癌细胞的功效，还具有抑制人乳腺癌细胞增殖作用及小鼠体内抗肿瘤功效。