[发明专利]水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用

说明书

技术领域

 本发明涉及一种流式细胞术检测水通道蛋白-4自身抗体的方法及其融合表达病毒载体。水通道蛋白（aquaporin, AQP）-4抗体阳性是视神经脊髓炎诊断的重要支持条件，抗体滴度与患者病情的严重程度、预后、复发具有相关性。本发明属于疾病分子鉴定和诊断领域，结合病毒载体构建，转染，荧光免疫染色及流式细胞分析技术，主要应用于NMO和MS的临床鉴别诊断，提高NMO和MS的诊断水平；能辅助作为用药疗效、病情监测、复发预测的指标；AQP-4检测平台的建立能为进一步研究AQP-4抗体的致病机制提供基础。

背景技术

多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）和视神经脊髓炎（neuromyelitis optica, NMO）是中枢神经系统最为常见的脱髓鞘疾病，已成为中青年非外伤致残首要疾病之一。两种疾病均常累及视神经和脊髓，因此临床上较难区分，尤其是发病早期。目前研究认为MS是由CD4辅助T细胞(包括Th1和Th17亚群)介导的自身免疫疾病，故治疗多以免疫调节为主，如β-干扰素等。而NMO以体液免疫为主，治疗多以免疫抑制为主。因此，早期鉴别诊断对指导两种疾病的治疗和评估预后非常重要。2004年Lennon等通过间接免疫荧光染色方法检测发现视神经脊髓炎病人血清中存在着一种特异性自身抗体NMO-IgG，它在视神经炎（Optic neuritis,ON)、长节段横贯性脊髓炎(Longitudinally extensive tranverse myelitis,LETM)患者血清中的阳性率也较高，2006年Wingerchuk DM修订了NMO诊断标准，将NMO-IgG抗体阳性做为诊断的重要支持条件，该诊断标准强调了水通道蛋白-4抗体在NMO诊断中的重要价值。在此基础上，Wingerchuk DM 又于2007年提出了视神经脊髓炎疾病谱，认为ON、LETM（包括伴有自身免疫病和/或有颅内病灶）为视神经脊髓炎的限定型，连同视神经脊髓型多发性硬化（OSMS）一同被归为NMO的疾病谱。后续研究还发现，AQP4抗体滴度与患者病情的严重程度、预后、复发具有相关性，临床上用免疫球蛋白和血浆置换治疗NMO疗效较好。NMO患者尸检的病理显示病灶中血管周围有大量的免疫球蛋白和补体沉积、星型胶质细胞破坏和再生，其分布与AQP-4表达的分布相一致。通过AQP-4抗体阳性血清与转染AQP-4cDNA的HEK293细胞孵育，并用抗人IgG示踪已结合的抗体，发现NMO中的AQP-4抗体为IgG1，而IgG1具有激活补体功能。进一步的体外实验证实AQP-4抗体与表达AQP-4分子的HEK细胞结合后能激活补体。2009年Bennett等研究发现，在已经诱导出EAE的大鼠鞘内注射人工合成的AQP-4抗体能够导致病灶内星型胶质细胞的死亡，与NMO病灶病理改变相似。这提示AQP4抗体可能不仅仅是NMO的标志物，有可能是致病性抗体。

目前国际上检测AQP-4抗体的技术主要有间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence, IIF)、荧光免疫沉淀法(Fluoroimmunoprecipitation Assay, FIPA)、放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay, RIPA)、荧光免疫细胞染色法(Cell-Based  Assay,CBA)（文献支持Clin Immunol. 2011 Mar;138(3):239-46, Neurology. 2012 Feb 28;78(9):665-71；）及酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。其中以CBA和FIPA的敏感性和特异性最为理想。然而，CBA法平均检测周期超过两天，荧光效率不稳定，而且需要人为观察 ，费时费力，而且可能会增加检测中的人为误差；FIPA法涉及到同位素的应用，环境危害性大大增加。此外，针对AQP-4自身抗体的检测国内目前只少数研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常规应用于临床，因此何种方法作为“金标准”被推荐应用于临床AQP-4抗体的检测尚待阐明。

传统检测AQP-4的方法如间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法等敏感性和特异性均不高，放射免疫沉淀法涉及放射源污染问题。因此，我们应用稳定转染AQP-4的细胞系，采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色法（CBA）结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测AQP-4抗体。