[发明专利]一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：主要包括引物对P2和引物P3，

引物对P2为：

F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，

R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；

引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。

2.根据权利要求1所述的鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：还包括dNTP mix、Hotstar Taq、iPLEX单碱基延伸酶、缓冲液、MgCl₂及iPLEX终止反应Mix。

3.根据权利要求2所述的鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：包括500nM引物对P2480μL、500nM单碱基延伸引物P3480μL、25mM dNTP mix48μL、5U/μL Hotstar Taq48μL、iPLEX单碱基延伸酶19.68μL、10×PCR buffer300μL、25mM MgCl₂156μL、超纯水888μL、iPLEX终止反应Mix96μL、1U/μL SAP酶240μL、10×SAP buffer81.6μL。

4.一种鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）PCR扩增：以鸡全基因组DNA为模板，利用引物对P2进行PCR扩增；

（2）SAP纯化：PCR扩增后，利用碱性磷酸酶消化反应剩余的dNTPs；

（3）单碱基延伸：消化处理后，利用引物P3进行单碱基延伸反应；

（4）样本分析：取步骤（3）处理的样本，利用MALDI-TOF技术进行质谱分析；

引物对P2为：

F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，

R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；

引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。

5.根据权利要求4所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中PCR扩增的反应体系为：超纯水1.85μL、10×PCR buffer0.625μL、25mM MgCl₂0.325μL、25mM dNTP0.1μL、5U/μL Hotstar Taq0.1μL、500nM Primer mix1μL、10ng/μL鸡全基因组DNA1μL，总体积5μL。

6.根据权利要求5所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃30s，72℃退火60s，72℃延伸5min，45个循环；4℃保存。

7.根据权利要求4所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中消化反应为：在PCR扩增产物中加入1U/μL SAP酶0.3μL、10×SAP buffer0.17μL和超纯水1.53μL；反应程序为：37℃，40min；85℃，5min；4℃保存。

8.根据权利要求4所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中单碱基延伸反应为：在消化产物中加入超纯水0.755μL、10×iPLEX buffer0.2μL、反应浓度为1×终止反应iPLEX Mix0.2μL、7μM/14μM单碱基延伸引物0.804μL和反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μL；反应程序为：94℃30s，40个循环：94℃5s，52℃5s和80℃5s×5个内部循环，72℃3min；最后4℃保存。