[发明专利]一种登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗制备和应用

说明书

本发明公开了一种登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗，其是以真核表达质粒pcDNA3.1(‑)为载体骨架，以Igκ链信号肽为引导序列，包含有登革病毒1型中15个高度保守的免疫优势CTL表位和1个通用型辅助性T细胞表位，各表位间由1‑4个氨基酸组成的Linker连接。该DNA疫苗免疫HLA‑A*0201转基因小鼠、HLA‑A*1101转基因小鼠和HLA‑A*2402转基因小鼠后，可诱导产生CTL表位特异性分泌IFN‑γ的CTL，后者可以杀伤负载CTL表位的小鼠脾细胞和登革病毒1型感染的小鼠脾单核细胞。该DNA疫苗具有广泛人群覆盖率(通用型)，在登革病毒的免疫治疗和预防方面具有巨大的潜在价值。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域；更具体地，本发明涉及登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗的构建和应用。

背景技术

登革病毒(DENV)是一种引起登革热(DF)以及致死性登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的黄病毒属蚊媒病毒。DENV的四种不同的血清型(DENV-1，2，3，4)均可通过埃及伊蚊和白纹伊蚊的叮咬传播给人类。DENV已流行于热带和亚热带的100多个国家和地区，每年约有5000万-1亿的DF病例和25万-50万的DHF／DSS病例。目前，登革病毒1型(DENV-1)是世界上流行的主要的血清型。自1978年中国广东重现DENV以来，广东、海南、台湾、云南、广西等地区每隔几年就会出现DENV的流行和爆发，而且福建、浙江、上海、贵州等地区也时有输入性登革病例报道。近年来，由于全球气候变暖、人口快速增长及频繁流动、病毒株变异等因素的影响，DENV流行的国家和地区不断增加，其不但对全球人类健康构成了极大的威胁，而且给公共卫生事业造成了极大的经济负担。虽然多年来的研究已经广泛地了解了DENV感染的特征，但在研制特异性的有效抗DENV的药物方面并没有取得突破性的进展，因此研制具有较好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗具有重要的现实意义和社会效应。

DENV感染或接种登革传统疫苗(灭活疫苗或减毒活疫苗)诱导机体产生的非中和抗体具有介导抗体依赖性增强效应的作用(ADE作用，在机体二次感染不同DENV血清型时可加重病情)，而DENV感染机体诱导的细胞毒性T细胞(CTL，活化的CD8+T细胞)可以杀伤DENV感染的细胞，对机体具有保护效应。由于，CTL表位是抗原中诱导特异性CTL反应的最基本的结构和功能单位，不含有可诱导副作用(如ADE作用)的成分。因此，基于CTL表位的CTL表位DNA疫苗(采用基因工程的方法将编码多个CTL表位的基因连接并插入表达质粒)是一种很有希望的兼具免疫预防和免疫治疗作用的新型疫苗。此种DNA疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达并被加工释放出单个CTL表位，后者即可诱导CTL表位特异性CTL反应。与传统疫苗相比，CTL表位DNA疫苗具有成本低、便于贮藏和运输、安全性高、在体内维持时间长、制备简单、无潜在副作用(如ADE作用)等优点。

HLA-A的三个等位基因HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402在不同种族人群中总的覆盖率均超过80％。因而选择多个受HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402限制的CTL表位，将其基因片段串联起来插入真核表达载体，构建成CTL表位DNA疫苗，这样既增加了CTL表位的密度，又增加了重组抗原的人群覆盖范围(具有通用型)。HLA-A*0201转基因小鼠、HLA-A*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠分别表达人的HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402分子，是研究HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402限制性CTL反应及评价多表位DNA疫苗免疫原性的重要动物模型。

由于目前尚缺乏防治DENV感染的特效方法，因此迫切需要研发出可用于防治DENV感染的新型疫苗，尤其是基于CTL表位的CTL表位DNA疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用DENV-1的CTL表位构建登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗的方法，及其在机体免疫以及疫苗制备中的应用。