[发明专利]一种基于胃液多重实时PCR检测的幽门螺杆菌（HP）个体化治疗辅助诊断方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于胃液的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称H.pylori或HP）感染个体化治疗辅助诊断多重实时（Real-Time）PCR检测方法。

背景技术

HP能够引起慢性胃炎、胃溃疡等消化道相关疾病，是WHO癌症协会规定的原核生物中唯一的I类致癌因子。以质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）结合阿莫西林和克拉霉素（或者甲硝唑）等抗生素的三联疗法或四联治疗等，是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合。然而，由于克拉霉素的耐药率的不断上升，这种疗法的成功率正在逐渐的下降。另一个影响这种三联用药的成功率的是人类的细胞色素P450的同工酶CYP2C19基因的多态性，其基因类型决定了PPI在人体内降解的速度。因此，在使用三联疗法治疗HP感染之前，如果能提供准确的克拉霉素药敏结果和CYP2C19基因类型，进行针对性的选择药物，能够很好地保证治疗的成功率。然而，传统的培养和药敏试验以及其他快速检测方法，并不能满足这一要求。我们设想通过实时PCR方法在一次实验中能够从尽可能少量的胃液标本中检测HP感染，评价克拉霉素耐药情况，并提供患者CYP2C19基因类型。

发明内容

本发明为了解决上述问题，提供了一种基于胃液的HP感染个体化治疗多重实时PCR检测方法，仅需待检者提供10-500μl胃液，即可在一次试验中从胃液标本中检测到是否存在HP感染、评价其克拉霉素耐药情况，同时完成患者CYP2C19的基因类型检测。

一种基于胃液的幽门螺杆菌个体化治疗多重实时PCR检测方法，包括：

a)用胃液中脱落上皮细胞的核糖核酸酶P（Rnase P）内参基因、幽门螺杆菌特异基因cagH、HP23S rRNA克拉霉素耐药突变位点A2143G和A2142G、CYP2C19基因（CYP2C19*2（G681A）、CYP2C19*3（G636A））分型检测的引物和探针及荧光标记；

b)胃液的预处理方法；

c)检测所需胃液量；

d)多重实时PCR分管组合、反应体系及反应条件；

e)检测结果判读标准；

f)阳性对照、阴性对照。

所谓的基于胃液的幽门螺杆菌个体化治疗多重实时PCR检测方法是指通过提取患者胃液中的核酸，能同时检测HP特异基因cagH（提示患者是否感染HP）、HP23S rRNA克拉霉素耐药突变位点（评价HP克拉霉素耐药情况）及CYP2C19基因多态性（提示CYP2C19酶代谢类型）。

所谓的内参基因（Rnase P）是为了保证试验中模板提取的正确性和初步估计模板的浓度。

本发明通过分析我国HP流行菌株cagPAI上的一段保守区cagH及HP23S rRNA克拉霉素耐药突变位点和人类CYP2C19PPI代谢相关基因，分别设计了不同的引物和荧光标记探针，建立了包括胃液预处理方法、检测所需最小胃液量及多重实时PCR检测技术在内的综合方案。

本发明所述方法仅需要待检者提供胃液，属于非侵入性检测，患者依从性好，检测所需胃液量小（为10-500μl）。所述的检测所需最少胃液量指的是每次试验仅需患者提供10-500μl胃液进行预处理后再进行核酸的提取，即可满足后续包括检测到HP的感染、评价其克拉霉素耐药情况，同时完成患者CYP2C19的基因类型检测。

为避免胃液中的离子浓度、pH值影响核酸的质量从而影响PCR的扩增效率，本发明提供了一种胃液预处理方法，即将新鲜（或融化的冻存）的胃液标本进行涡旋震荡至均匀，取出10-500μl胃液标本，加入等量的Tris缓冲液（0.67M，pH7.4），振荡均匀，室温放置2h。13000rpm离心5min，弃上清留沉淀。后续步骤按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。所述的Tris缓冲液（0.67M，pH7.4）的配制方法如下：取81.16g Tris至800ml dd H₂O中，滴加浓盐酸至pH7.4，加入ddH₂O定容至1L。