[发明专利]一组耐螯合剂乙二胺四乙酸的重组碱性木聚糖酶及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于工业酶开发利用领域，特别涉及一组耐螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)的重组碱性木聚糖酶和其编码基因，及其构建方法。

技术背景

造纸工业是世界上六大污染工业之一，我国造纸行业年排放废水量达40万吨，占全国工业废水排放量的1/6。多年来，人们不懈地努力，试图开发出无污染和高效率的制浆造纸新工艺，以减少污染，保护环境。造纸工艺中的制浆和漂白工序是污染物产生的主要工序。生物技术可以帮助解决这些问题，其中最具吸引力和挑战性的是生物制浆和生物漂白。因为造纸工业废水主要由蒸煮黑液和漂白废液组成，采用生物制浆和生物漂白可以有效减少这些废液的产生。传统的化学漂白法是采用多段的氯/二氧化氯漂白及碱提取来去掉木质素，在废水中会含有大量含氯的、致癌致畸的物质，如呋喃、二噁英等，造成严重的环境污染和生态破坏。80年代初，西方工业国家工业污染控制战略出现了重大变革，以污染预防取代了污染治理。芬兰率先将生物漂白技术引进纸浆造纸工业中。用木聚糖酶对纸浆进行预漂白，可以减少随后的化学漂白用氯量30％-40％，废液中有机氯化物与毒化物含量显著减少。酶法助漂新工艺在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。采用基因工程与蛋白质工程手段获得性质优良的耐热耐碱耐化学试剂的木聚糖酶已成为各相关实验室的研究热点。

木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物细胞中主要的半纤维素成分。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它在饲料、造纸、食品、能源工业和环境科学上有着广阔的应用前景。目前一些国家已经开展使用木聚糖酶漂白纸浆，如欧洲、北美、南美、日本等，将酶作为工业漂白预漂剂。木聚糖酶助漂新工艺已成为发达国家造纸工业中较为成熟的生物技术，在加拿大有超过10％的硫酸盐漂白浆采用了木聚糖酶漂白。1986年，在国际造纸工艺生物技术研讨会上，芬兰人Viikari等首次报道，松木和桦木Kraft浆经过木聚糖酶预处理后可以降低漂白氯耗，提高白度。

本发明前期研究的碱性木聚糖酶基因xynA来源于短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，含有687bp的开放阅读框，编码228个氨基酸，通过信号肽预测工具SignalP分析，显示该氨基酸序列含有27个氨基酸的信号肽。将该基因的成熟片段xynA-M在大肠杆菌中进行了表达，表达所得成熟木聚糖酶经纯化后进行酶学性质的研究表明，这种碱性木聚糖酶在pH9.2、60℃和5mM EDTA条件下，酶活显著降低。

在工业应用中，大部分碱性木聚糖酶不具备耐螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)的能力，在造纸漂白工艺中，据芬兰统计，其国内超过1/2的化学浆厂和2/3的机械浆厂在使用螯合剂。随着TCF(Total Chlorine Free)和ECF(Elemental Chlorine Free)漂白流程以及水封闭循环的更广泛应用，EDTA在全世界的用量有不断增加的趋势，对螯合剂的研究也得到更多地重视，因此，获得更多高效、稳定的耐EDTA的碱性木聚糖酶有利于推动木聚糖酶在溶解纸浆和漂白纸浆生产中发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的是提出一组高效、稳定的耐乙二胺四乙酸(EDTA)的重组碱性木聚糖酶及编码基因，及其构建方法。

本发明是这样实现的。在GenBank收录号EU421717.1中含有的木聚糖酶基因xynA，对应木聚糖酶XynA的氨基酸序列收录号为ACA00160.1，除去N-段的27个氨基酸信号肽，剩下的201个氨基酸是该木聚糖酶的成熟片段XynA-M，对应的木聚糖酶基因成熟片段是xynA-M。针对xynA-M，分别设计点突变引物(FP1：、RP1、FP2、RP2、FP3和RP3，序列如下)进行定点诱变。利用突变引物FP1和RP1将公布的基因56、57位的鸟嘌呤G分别变成腺嘌呤A和胸腺嘧啶T，利用突变引物FP2和RP2将公布的基因将56、57位的鸟嘌呤G分别变成胸腺嘧啶T和胞嘧啶C，利用突变引物FP3和RP3将公布的基因将55、56和57位的胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G分别变成胞嘧啶C、腺嘌呤A和胞嘧啶C，使得编码的木聚糖酶的成熟肽第19位的色氨酸W分别突变成酪氨酸Y、苯丙氨酸F和组氨酸H，获得一组耐5～10mM EDTA的重组碱性木聚糖酶基因xynA-M-W19Y、xynA-M-W19F和xynA-M-W19H。

重组碱性木聚糖酶基因xynA-M-W19Y的氨基酸序列具体如下：

其G、G分别变A、T的DNA序列如下：