[发明专利]一组耐螯合剂乙二胺四乙酸的重组碱性木聚糖酶及其构建方法

权利要求书

1.一种耐 EDTA 的重组碱性木聚糖酶，其特征在于：在 GenBank 收录号 EU421717.1 中含有的碱性木聚糖酶基因xynA，对应成熟木聚糖酶基因 xynA-M，分别设计点突变引物 FP1和RP1，进行定点诱变，将公布的基因第56、57 位的鸟嘌呤G分别变成腺嘌呤A和胸腺嘧啶T，使得其编码氨基酸序列成熟肽的第19位的色氨酸W突变成酪氨酸Y，获得耐5～ 10mM EDTA 的重组碱性木聚糖酶XynA-M-W19Y。

2.一种耐 EDTA 的重组碱性木聚糖酶的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1）PCR 方法克隆得到权利要求1中所述的碱性木聚糖酶基因xynA；

2）设计引物FP、RP，并引入BamHI、HindIII 酶切位点，采用PCR方法分离克隆了成熟木聚糖酶基因xynA-M，全长606个bp，将xynA-M基因用限制性内切酶BamHI和HindIII 酶切处理，琼脂糖凝胶电泳胶回收，得到酶切产物xynA-M；

FP：CGCGGATCCGAGACAATCTACGACAACCG

RP：CCCAAGCTTCTGCAGTTATCTGCCGATC

3）将步骤2）获得的成熟木聚糖酶基因xynA-M连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，得到重组载体pET28a-xynA-M；

4）设计将成熟肽的第19位氨基酸W突变成Y的点突变引物FP1和RP1：

FP1：5’CTTCGAGCTGTATAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG 3’；

RP1：5’TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG 3’；

将步骤 3）获得的重组载体pET28a-xynA-M作为模板进行全质粒反向PCR；

5）将步骤 4）获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR片段，用DpnI、PNK对回收的PCR片段进行去模板消解和磷酸化，体系为：1μl DpnI，1μl PNK，2μl 10×FD buffer，2μl dATP，10μl PCR片段，加灭菌ddH₂O至20μl；37℃处理12小时，70℃处理15 分钟灭活后，向上述体系中加入1μl T4Ligase Buffer，1μl PEG4000，1μl T4Ligase，置于22℃金属浴保温30分钟后，直接转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 表达感受态细胞中，挑选两个转化子经测序得到含点突变的重组载体的重组菌株BL21(DE3)／ ET28a-xynA-M-W19Y ；

6）将重组菌株BL21(DE3)／pET28a-xynA-M-W19Y按照常规的大肠杆菌诱导表达重组蛋白方法，获得重组蛋白XynA-M-W19Y，测定木聚糖酶的活性。