[发明专利]利用电化学发光法检测治疗性抗体类药物的细胞结合活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测治疗性抗体类药物的细胞结合活性的方法，特别是涉及一种利用电化学发光法检测治疗性抗体类药物的细胞结合活性的方法。

背景技术

现阶段，国内生物制药行业在检测大分子抗体药物与其受体的结合活性时，主要是通过酶联免疫吸附(ELISA)的方法。ELISA作为常规的结合活性方法，在检测大分子抗体药物与其受体的结合活性时存在一些难以克服的问题：1）一些抗原表位(如受体)难以获得商业化的产品，或受体提取制备比较困难；2）在做细胞结合试验(cell-based binding assay)时，细胞无法包被在板上，尤其是悬浮细胞；3）实验过程中需要反复的清洗，多步骤，比较繁琐耗时。目前，另一种细胞结合试验是通过流式细胞仪来检测，虽然用流式细胞仪检测不用多次清洗，但却存在仪器本身的技术平台问题：当一些受体在细胞表面表达很高时，会超出仪器的检测限，在做活性试验时会检测不到上平台，从而无法定量；同时在每次使用流式细胞仪前都需要校正，比较费时。

电化学发光（ECL）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。包括了两个过程，电化学反应过程：在工作电极上（阳极）加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³⁺，同时电极表面的三丙胺自由基（TPA）也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA⁺，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基（TPA），这样在反应体系中就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³⁺和具有强还原性的三丙胺自由基（TPA）。化学发光过程：具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³⁺和具有强还原性的三丙胺自由基（TPA）发生氧化还原反应，结果使三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³⁺还原成激发态的二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺,其能量来源于三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³⁺与三丙胺自由基（TPA）之间的电势差，激发态[Ru(bpy)₃]²⁺以荧光机制衰变并以释放出一个波长为620nm光子的方式释放能量，而成为基态的[Ru(bpy)₃]²⁺.上述化学发光过程后，反应体系中仍存在二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺和三丙胺自由基（TPA），使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以继续进行，这样整个反应过程可以循环进行。通过上诉的循环过程，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大大的提高。

电化学发光免疫法是新一代的标记免疫测定技术，既兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性，因此，具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用电化学发光法（ECL）检测治疗性抗体类药物的细胞结合活性的方法。该方法是针对现有ELISA和流式细胞仪测定细胞结合试验的缺点进行开发的，而且本发明的方法能解决流式细胞仪检测细胞表面高表达受体所存在的仪器缺陷，同时实现了用细胞铺板能更直接的反应其生物学活性，为cell-based binding assa_y提供一种更灵敏、简洁有效的方法。

为解决上述技术问题，本发明的利用电化学发光法检测治疗性抗体类药物的细胞结合活性的方法，包括步骤：

1）将细胞铺于96孔板中，孵育1～2h；

2）加入封闭液，孵育30min～1h进行封闭；

其中，封闭液是含体积浓度为10%～30%FBS（胎牛血清）的缓冲液；

3）缓冲液清洗后，加入治疗性抗体类药物，孵育1～2h；

4）缓冲液清洗后，加入钌标记的抗人IgG（Goat Anti Human Antibody,SULFO-TAG Labeled），孵育1～1.5h；

5）缓冲液清洗后，加入无表面活性剂的MSD read缓冲液；

6）用MSD Sector Imager6000读96孔板，得到细胞结合活性结果。