[发明专利]一种RNA的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及一种RNA的制备方法。

背景技术

现有RNA合成技术均采用固相化学合成，与DNA的合成相比，需要对2’-OH进行特殊的保护，在合成结束后，统一再对2’-OH进行脱保护，这样造成了较高的RNA合成成本。同时，RNA序列在合成过程中，每添加一个核糖核酸，最优产物转化率也仅在97～99%之间，对于长RNA序列，例如，100ntRNA，收率一般在10%以下，对核糖核苷酸原料是一种浪费。

除了固相化学合成外，现有RNA合成技术还包括启动子引发的酶法RNA合成，该方法虽然能克服化学合成存在的一些固有问题，但是其合成必须依赖双链DNA形式的启动子序列，并且对RNA序列的合成具有偏好性，5’端富含嘌呤的RNA合成效率远高于不含嘌呤序列。同时，启动子依赖的酶法RNA制备需使用DNAzyme等酶切初级产物，DNAzyme的切割也有序列偏好性，能切割的RNA序列有限，因此可以用该方法合成的RNA种类也有限。此外，DNAzyme切割的效率不及蛋白酶，且容易受催化微环境的影响。以上的问题阻碍了启动子依赖的酶法RNA制备作为化学合成RNA的代替方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RNA的制备方法，旨在解决现有技术所存在的问题与不足。

本发明是这样实现的，一种RNA的制备方法，包括以下步骤：

（1）设计与目的RNA互补的cDNA，将所述cDNA在短链DNA和DNA连接酶的作用下连接成环，形成环状DNA；

（2）利用RNA聚合酶，以滚环扩增的形式合成出长链RNA，该长链RNA含有所需RNA序列的串联重复序列；

（3）利用特异性的核酸序列和其它酶或者化合物，将串联产物在特异性位点切割，生成所需序列。

优选地，在步骤（1）中，所述短链DNA序列和cDNA链的首尾序列进行碱基互补配对，并使cDNA首尾相接，形成环状cDNA。

优选地，所述短链DNA长度为11～15nt。

优选地，在步骤（2）中，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶、E.coliRNA聚合酶或Syn5RNA聚合酶。

优选地，在步骤（3）中，所述特异性的核酸序列为氧甲基化修饰的短链DNA序列，所述DNA序列同RNA产物在预期位置互补配对结合，并在RNaseH的作用下，在特定位点切割RNA，得到目的RNA序列。

本发明克服现有技术的不足，提供一种RNA的制备方法，通过将线性cDNA模板在短链DNA和DNA连接酶的作用下连接成环，形成环状cDNA；利用RNA聚合酶，以滚环扩增的形式合成出长链RNA，含有所需RNA序列的串联重复序列；最后利用特异性的核酸序列和其它酶或者化合物，将串联产物在特异性位点切割，生成所需序列。

在本发明中通过将滚环扩增（RCA）与RNaseH酶切技术结合来制备RNA，其中，RCA是以环状DNA为模板，通过一个短的DNA/RNA引物（与部分环状模板互补），在酶催化下将NTPs转变成单链核糖核酸，产物单链包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法可以直接扩增合成单链的RNA。RCA以往多用于信号扩增检测目标核酸分子，但由于其产生单链的特性，可以用来合成制备RNA。RCA扩增的产物为单链的RNA，是模板cDNA的互补序列。通常情况下，RCA可以将模板扩增10³～10⁴倍，产物均为串联重复序列。在此基础上，结合RNA聚合酶作用下的滚环扩增和特异性RNA剪切的方法生产所需RNA，扩增效率可以达到10⁴～10⁵。

本发明采用环状DNA模板进行扩增合成，不需要再制备双链DNA形式的启动子序列以引发扩增。同时，滚环扩增的产物为长链的目的RNA的串联重复序列，克服了RNA聚合酶5′选择性和3′末端随机添加1～2nt碱基的缺点。同时，对产物可以选用多种方法进行切割。其中利用修饰的核酸序列同RNaseH联合进行RNA的特异性切割，对RNA的切割没有序列限制，可以根据要求合成任何序列的RNA。同时RNaseH的催化效率较高，并且不易受pH、温度和体系离子强度的影响。

因此，本发明RNA合成过程更加简洁、高效，并且合成的RNA序列具有高忠实度，过程中不产生原料浪费，对于产物不需要再进行冗繁的修饰，更加经济，尤其适用于大量小RNA的合成。

附图说明

图1是本发明的RNA的制备方法的全部步骤示意图；

图2是本发明实施例中线性cDNA成环原理示意图；