[发明专利]一种PD-1蛋白胞外段亲和肽L8及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程医学技术领域，具体涉及一种PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8及其应用。

背景技术

近年来，随着全球经济科技的飞速发展，环境问题越来越恶劣，从而使人类的健康受到很大的威胁，尤其是近几十年来癌症患者的数目直线增长，但传统的手术治疗、放疗、化疗的技术已经不能取得很好的疗效或者是预后性较差。因此，寻找新的治疗手段和治疗药物一直是全球范围内的研究热点。与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。

在肿瘤免疫治疗中，效应T细胞是主要的杀伤肿瘤的细胞，但T细胞的激活需要两个信号的刺激，第一信号是识别信号，即肿瘤抗原等内源性抗原被树突状细胞（DC）等抗原递呈细胞（APC）加工处理后以MHC/表位复合物的形式递呈至APC的表面，该复合物能被T 细胞表面的T细胞受体（TCR）识别，从而形成了激活 T 细胞的第一信号；与此同时，T细胞和APC表面表达的多对共刺激分子相互作用产生了T细胞活化的第二信号。

根据产生的效应不同，可将共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。在正性共刺激分子中，最重要的是 CD28 和 ICOS 等分子；在负性共刺激分子中，最重要的是CTLA-4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CD152）和PD-1（程序性死亡-1，programmed death-1，CD279）等分子。在肿瘤免疫治疗过程中，负性共刺激分子主要介导免疫耐受和逃逸。

PD-1分子最早是通过削减杂交技术从小鼠处于凋亡状态的杂交瘤及造血祖细胞系克隆得到的，它被认为与细胞凋亡相关，因而命名为程序性死亡-1（programmed death-1），在2004年12月第八届国际人类白细胞分化抗原会议上被命名为CD279。PD-1共有288个氨基酸组成，相对分子质量是55000，是一种跨膜糖蛋白，其胞外区包含一个IgV样结构域，有4个重要的N连接糖基化位点，并被重度糖基化。PD-1及其配体PD-L1是T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞无能和免疫耐受维持方面起着非常重要的作用，并介导了肿瘤免疫耐受和逃逸。

PD-1是一种免疫球蛋白超家族激活诱导的抑制性受体。前人在肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，研究通过抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的对肿瘤细胞的免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明提供了一种PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8，并经过实验证明了该亲和肽L8具有抗肿瘤活性。

本发明采取的技术方案如下：

一种PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8，其氨基酸序列为：Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-Ser，即：S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T-S，分子量为1293.7。

所述PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8在制备抗肿瘤相关药物中应用，所述肿瘤为结肠癌瘤或黑色素瘤，所述抗肿瘤为抑制肿瘤生长或消除肿瘤。

所述PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8采用Fomc固相多肽合成法合成，简要步骤如下：

（1）选用Rink树脂与待合成肽即PD-1亲和肽L8的C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，并让其与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应，形成肽键；

（2）然后，将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护，再让第二个氨基酸的N端与后面的氨基酸的羧基反应，如此不断重复这一过程直至多肽合成完毕；

（3）最后，将合成的多肽从树脂上切割下来，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽；

（4）经脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，得纯度大于95%的本发明PD-1亲和肽L8。

本发明所提供的PD-1蛋白胞外段亲和肽L8是通过固相筛选法进行噬菌体展示十二肽库的筛选工作时所获得的；通过对其进一步的动物实验验证，其对肿瘤的抑制效果明显，无明显副作用，能够明显提高实验动物的生存期，具有较好的医疗应用前景。PD-1蛋白胞外段亲和肽L8的制备方法较为成熟、完善，便于制备相应的生物医药制品，因而本发明具有较好的实际应用推广意义。

附图说明

图1为PD-1蛋白胞外段亲和肽L8的ESI-MS质谱分析鉴定结果；