[发明专利]内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用

权利要求书

1.一种内生生防菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），己于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.8812。

2.一种根据权利要求1所述菌株的制备方法，其特征是：第一步，内生生防菌株的分离和纯化，采集健康的石榴叶片称取3.0 g，用无菌水冲洗4~5次，无菌剪刀剪成4~5 mm见方的小块后，依次用75%的酒精浸泡5 s，0.1 %的升汞浸泡50 s，无菌水冲洗3次，然后加30 mL无菌水在无菌研钵中研磨；研磨后静止分层，上清液作为浸出液备用，其浓度为0.1 g/mL，取上清液1 mL进行梯度稀释至10^-5，从10^-3、10^-4、10^-5稀释悬液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次冲洗液0.2 mL涂布平板进行无菌检验，每处理3个重复；在37℃恒温培养箱中倒置培养24~48 h，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用平板划线法进行纯化；纯化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37℃培养24 h，4℃冰箱保存备用；第二步，内生生防菌株的筛选，首先将石榴腐烂病菌在马铃薯葡萄糖培养基平板上28℃培养至产生孢子，用接种环挑取少量的病原菌孢子点接到马铃薯葡萄糖培养基平板中央，在距平板中央3 cm的两条对称直线处划线接种已分离的内生菌株，以只接石榴腐烂病菌为对照，28 ℃恒温培养箱中培养，待对照中病菌菌丝即将铺满全皿时，计算抑制率的大小，筛选出抑菌效果较好的菌株；第三步，将筛选出的内生生防菌株进行保存，第一种保存方法，将选择培养的内生菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨斜面上，培养24 h后置于4℃冰箱保存，半年转管一次防止培养基干涸菌种死亡，供临时使用，第二种保存方法为甘油保存：将内生生防菌株用无菌水悬浮，充分混匀制成菌悬液，取20 %的灭菌甘油与菌悬液在涡旋震荡器上充分混匀转入无菌的1.5 mL EP管中，于﹣80 ℃冷冻长期保存。

3.根据权利要求2所述菌株的制备方法，其特征是：所述灭菌甘油与菌悬液的体积比为2：1。

4.一种根据权利要求1所述的内生生防菌株生防菌剂，其特征是：生防菌剂浓度为1×10⁸ cfu/mL的内生生防菌株细胞悬液。

5.一种根据权利要求4所述生防菌剂的制备方法，其特征是：挑取活化的内生生防菌株少许，接种到10 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃，180 r/min摇床培养24 h，作为种子液；将种子液按1%（v/v）的比例接种于含200 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基的1L三角瓶中，37 ℃，180 r/min摇床培养48 h，得到发酵液，2 500 r/min离心6 min，收集菌体用无菌水洗涤，用清水配成浓度为1×10⁸ cfu/mL的内生生防菌株细胞悬液，即为内生生防菌株生防菌剂。

6.一种根据权利要求4所述的生防菌剂在防治石榴贮藏期果实腐烂病的应用，其特征是：将石榴果实用清水洗净、风干，将石榴果实浸入生防菌剂中10 min，取出后沥干萼筒内的残留溶液并预冷至5℃左右，再用0. 025~0.03 mm 厚的聚乙烯袋单果包装，装箱入库，保存温度为4~6℃，相对湿度为90%。