[发明专利]重组人DKK1多表位核酸疫苗、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及重组人DKK1多表位核酸疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性系统性自身免疫性疾病，以侵蚀性滑膜炎及对称性、破坏性关节病变为主要病理学特征。最终可导致患者关节畸形和功能丧失，是造成人群劳动力丧失与致残的主要病因之一，给个人和社会带来沉重的负担。

由RA慢性、持续性炎症最终导致骨侵蚀的机制尚不清楚。因此，研究RA发病及骨损害的分子机制至关重要。近年来，越来越多的研究表明，Wnt信号通路在RA发病过程中起重要作用。Wnt信号可直接影响多潜能的前体细胞向软骨细胞和成骨细胞(Osteoblast,OB)分化的过程，并且通过上调OPG/RANKL/RANK系统中OPG/RANKL的比率影响破骨细胞(Osteoclast,OC)的发育成熟。目前，Wnt信号通路主要由两条途径调节骨代谢：（1）经典途径：Wnt/β-catenin信号通路，主要通过富集细胞内的β-catenin，进而促进β-catenin进入细胞核，调控下游成骨细胞靶基因的表达，促进成骨细胞分泌I型胶原而加速骨组织矿化，促进间充质前体和骨-软骨细胞前体增殖分化为成骨细胞和软骨细胞，延长成骨细胞的存活时间；并且抑制成骨细胞和破骨细胞的偶联，调节骨保护素（osteoprtegerin,OPG）和核因子-κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）的表达，影响骨吸收；使包埋在骨基质中的骨细胞最终分化为成骨细胞，并改变OB/OC的胞外基质以及在骨表面的定位，刺激骨折修复和影响骨重塑。（2）旁路途经：Wnt/Ca²⁺信号通路，主要通过调节G蛋白激活胞质中多种对Ca²⁺敏感的酶，包括磷脂酶C（phospholipase C，PLC），蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和钙离子-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium-calmodulin dependent kinase II，CamKII）等，进而调节细胞内Ca²⁺的释放；Wnt/PCP(Planar Cell Polarity)信号通路，主要通过小G蛋白RhoA和Cdc42等激活JNK（Jun N-terminal kinase），促进软骨细胞的去分化。目前为止，这些途径在骨和骨细胞的作用尚不很清楚。

DKK1是Wnt信号通路的抑制因子，属于DKK家族中的一员。DKK家族是在进化过程中很保守的一个基因家族，在脊椎动物中包括DKK1、2、3、4四个成员，都是分泌型糖蛋白，其中DKK1、2、4可以参与调控Wnt信号通路,尤其以DKK1抑制Wnt通路而介导骨破坏的途径及其拮抗剂的研究最为重视。人类DKK1基因位于10号染色体10q11.2，其编码的分泌性糖蛋白由266个氨基酸组成，结构上包括三个部分：（1）一个N端的信号序列，介导DKK1肽链穿越粗面内质网并分泌至细胞外。（2）两个保守的半胱氨酸富集区域。（3）靠近蛋白质C端的N-糖基化位点。DKK1是成骨细胞生长和分化的重要调节因子，DKK1与Wnt蛋白竞争性结合膜受体LRP5/6，并与膜受体Kremen结合，形成DKK1-LRP-Kremen复合体，经由吞饮作用进入胞浆并被溶酶体分解，从而减少了Wnt膜表面受体的数量，抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，下调胞浆β-catenin水平，抑制成骨细胞生长和分化的转录因子，使成骨细胞数量减少、活性降低、寿命缩短。同时，成骨细胞Wnt/β-catenin通路被阻断后，下调骨保护素的表达水平，从而促进破骨细胞的分化。可见，过表达的DKK1可抑制骨的形成并促进骨的吸收。研究表明，RA患者的血清和滑液中DKK1水平升高，并与疾病严重程度呈正相关，是介导RA骨损伤的重要致病因子。应用抗DKK1抗体治疗绝经后骨质疏松，可增加成骨细胞数量、提高血清骨钙素水平，增加小梁骨体积，促进膜内成骨，减少骨吸收。

目前临床上治疗RA的药物主要包括非甾体抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）、改善病情抗风湿药（disease modifying antirheumatic drug,DMARDs）及生物制剂等。这些药物在一定程度上缓解了RA病情，但并不能完全抑制骨结构破坏的放射学进展，因此开发抑制RA骨破坏的药物显得尤为重要。而DKK1作为Wnt信号通路的抑制因子在RA发病机制及骨侵蚀中起关键作用，可能成为RA治疗新的分子靶点。