[发明专利]一种基于SSR标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息技术领域，具体涉及的是一种基于SSR荧光标记和毛细管电泳技术的水稻指纹图谱构建方法。

背景技术

水稻是我国主要粮食作物之一，也是我国植物新品种保护条例涵盖的第一批保护作物之一。水稻种苗的真实性是衡量种苗质量的重要指标，直接影响水稻的产量、品质和经济效益。当前我国水稻种子和种苗存在纯度低、品质混杂、以次充好的现象，各级农作物品种审定机构和种子种苗生产部门对水稻品种伪劣鉴定日益重视，但是，水稻种子资源形态特征较为相似，特别是杂交种子表面上很难区分。传统的形态鉴定法依赖于表型差异，而形态性状受到气候、环境、营养状态和生物期等多种因素的影响，使得形态鉴定法的工作量加大，鉴定周期长。构建水稻指纹图谱，是现阶段控制水稻内在质量的有效手段。

DNA 分子标记能反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的DNA片段，可以从根本上揭示植物内在的基因差异，近年来已经广泛应用到作物品种鉴定和种质资源分类等研究领域。其中SSR（Simple sequence repeat）标记由于具有多态性高、数量丰富、遗传上呈共显性、结果稳定可靠、实验操作简单、引物序列易交流等优点，在水稻指纹图谱构建中表现出更为突出的应用价值。

传统的SSR-PCR扩增产物主要通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯凝胶电泳等生物技术来进行多态性分析的，这些方法虽然比较成熟但却非自动化，耗时、耗力，且不能准确读出扩增片段大小，难以统一处理不同批次的反应数据，在大规模、多批收集和分析数据时，仍具有相当大的难度。毛细管电泳（Capillay Electrophoresis，CE）是20世纪80年代后期在全球范围内迅速崛起的一种分离分析技术，该技术利用与遗传系统相匹配的电脑软件完成对数据的统一处理，操作简便，实现了分子标记研究与高效、自动化技术的结合，并且能准确读出扩增等位基因片段的大小，减少了人为误差，使得鉴定结果更为精确，更适用于水稻指纹图谱的建立。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量、容易实现自动化、结果准确可靠的水稻品种的鉴定方法，解决水稻纯度和真伪的鉴定难题，也可以对商品大米进行品种鉴定，保护品种所有人的合法知识产权。

本发明所提供的水稻品种的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）提取高质量水稻基因组DNA；（2）用筛选的SSR荧光引物进行PCR扩增；（3）将所得扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测；（4）得出所扩得条带大小；（5）通过数据统计分析获得0-1矩阵图；（6）根据0-1矩阵图绘制指纹模式图谱的胶板图。

作为本发明的进一步限定，所述水稻基因组DNA的提取方法为：（1）剪取0.02~0.04 cm²的水稻新鲜嫩叶装入96孔PCR板的孔中，加入100 μl DNA提取缓冲液，加入0.2 μl的100mg/ml蛋白酶K和1μl的10 mg/ml核糖核酸酶，用PCR板硅胶盖封盖好后于漩涡振荡仪上混匀；（2）在PCR扩增仪中设置以下反应程序并保存：首先设置温度为37℃，时间为30 min；接着设置温度为68℃，时间为20 min；然后设置温度为37℃，时间为30 min；最后设置温度为4℃，时间为∞；（3）将步骤（1）得到的PCR板放入设置好的PCR仪中进行反应；（4）反应结束后立刻将PCR板转置于冰面上进行冰浴10 min；（5）将PCR板放入冷冻离心机中，在4℃下3000 rpm离心10 min，取上清液即得DNA 溶液，置于-20℃保存备用。

作为本发明的进一步限定，所述SSR荧光引物为适用于水稻指纹图谱构建的5对核心引物，其中正向引物5'端以“CY5”磷荧光染料标记，合成荧光引物，并避光保存，所述的5对核心引物信息如下：

引物名称：RM206，引物序列：正向：5’-CCCATGCGTTTAACTATTCT-3’，反向：5’-CGTTCCATCGATCCGTATGG-3’，碱基重复：CT；

引物名称：RM71，引物序列：正向：5’-CTAGAGGCGAAAACGAGATG-3’，反向：5’-GGGTGGGCGAGGTAATAATG-3’，碱基重复：(ATT)10T(ATT)4；

引物名称：RM85，引物序列：正向：5’-CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’，反向：5’-GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’,碱基重复：(TGG)₅(TCT)₁₂，；