[发明专利]一种尿液中苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法

说明书

 

技术领域

本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪测定尿液中苯乙醇酸含量的方法。

背景技术

苯乙烯是塑料橡胶工业的重要原料，用以制造各种塑料树脂，合成橡胶，含有苯乙烯的塑料橡胶制品广泛用于日常生活和工业生产，如各种包装材料、隔热材料、一次性饭盒、纸杯、管道、容器等。苯乙烯还存在于卷烟烟气中。苯乙烯主要以气体形式通过呼吸道，或通过皮肤接触进入人体，短时间接触高浓度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激症状；长时间接触苯乙烯可引起肺组织结构损害，从而使人易患肺炎、肺气肿等疾病。国际癌症研究组织将其列为Group 2A，即对人类为很可能致癌物，对动物则为确定之致癌物。吸入体内的苯乙烯在CYP2B6和CYP2E酶的作用下代谢为苯乙烯7，8-氧化物，苯乙烯7，8-氧化物在环氧化物酶的作用下进一步代谢为苯乙醇酸和苯乙醛酸，苯乙醇酸的结构式如下，目前已经被用作苯乙烯暴露的生物标志物。

目前，分析尿液中苯乙醇酸的方法主要有：液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的方法。由于尿液基质比较复杂，采用液相色谱的方法检测往往需要经过复杂的前处理来净化样品，且由于仪器灵敏度不够，对于非职业暴露人群尿液中苯乙醇酸的检测存在挑战；而气相色谱质谱方法需要先进行衍生化；液相色谱串联质谱由于其灵敏度高、检测限低，因此被广泛的用于尿液中生物标志物的研究。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的测定尿液中的苯乙醇酸的LC-MS/MS方法，该方法能快速、准确检测尿液中苯乙醇酸的含量，测定结果准确、测定干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种尿液中苯乙醇酸的液相色谱串联质谱测定方法，包括以下工艺步骤：

a、收集志愿者尿液。

b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，经过0.22 μm的滤膜过滤，取200 μL的尿液，加入0.80 mL纯水，取2 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。

c、标准工作液的配制：用纯水配制不同浓度的苯乙醇酸标准工作溶液，浓度分别为5，10，20，50和100 ng/mL。

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的苯乙醇酸标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，苯乙醇酸的线性回归方程为y=1.35×10⁴x-1.34×10⁴，其中Y代表分析物的峰面积，X表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物的峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

本发明中选取了Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），初始流动相体系选取50% 溶剂A（水溶液）和50% 溶剂B（甲醇溶液），等度洗脱，流动相流速为400 μL/min，分析时间为10 min，进样量为2 μL。

串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；电喷雾电压：4500V, 雾化气：50 psi, 气帘气：35 psi, 辅助加热气：30 psi，射入电压：9 V，驻留时间：100 ms。选取m/z 149/77作为定量离子对，m/z 149/105为定性离子对。

本发明方法的线性范围和检出限：

用处理过的混合空白尿液配制系列标准曲线，苯乙醇酸的标准曲线的点为5，10，20，50和100 ng/mL，化合物的线性良好，相关系数为0.9990。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰10倍信噪比对应的浓度为定量限，3倍信噪比对应的浓度为检出限。方法的检出限和定量限分别为2.24 ng/mL和7.47 ng/mL。

本发明方法加标回收率和重复性：

采用尿液基质加标准品的方法测定方法的回收率。选取五个尿液样本，混合均匀以后，选取低、中和高三个添加水平加入标准品，每个浓度平行做6个重复，得到方法的回收率和精密度（以相对标准偏差（RSD）计）,见表1，方法的回收率范围是85.0-110.2%，RSD＜5%。

表1方法的回收率和精密度（n=6）