[发明专利]慢病毒干扰载体pll3.7-Neo及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以pll3.7为骨架，去除了GFP蛋白的表达序列并且插入Neo筛选标志的慢病毒干扰载体。 

背景技术

慢病毒载体（Lentiviral vector,LVs）是在HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）基础上改造而成的病毒载体系统。它能高效的介导基因表达或RNAi干扰作用，具有广泛感染谱，可以有效的感染分裂期和静止期细胞，并且能够长期稳定表达外源基因，因此成为导入外源基因的有力工具。目前市售的各种慢病毒载体主要分为两大类，一类是过表达载体，另一类是干扰载体。这两类载体大都带有puro抗性基因和（或）绿色荧光蛋白GFP基因，便于稳定细胞株的筛选和目的蛋白的定位。在细胞生物学以及细胞信号通路的研究中，往往需要在细胞中同时过表达或者敲除多个蛋白，然而现有慢病毒载体筛选标志基因的单一性，无法满足在一株细胞中同时过表达或者敲低两个以上蛋白，限制了慢病毒感染技术在复杂信号通路研究中的应用。 

发明内容

本发明的目的是针对现有的慢病毒载体存在的问题，发明一种带有Neo筛选基因，但删除GFP蛋白表达序列的慢病毒载体，从而便于对各种蛋白的过表达和敲除同时进行，并且不影响对目的蛋白在细胞中定位的观察。 

本发明提供的一种慢病毒干扰载体pll3.7-Neo，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。 

本发明提供的一种慢病毒干扰载体pll3.7-Neo的构建方法，包括如下步骤： 

（1）、根据pEGFP-C3载体中的从2160到3672共1512个碱基对，即SV40和Neo/Kana片段的碱基序列设计上下游引物SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，并且在上下游引物中分别加入Not1和EcoR1的酶切位点； 

（2）利用PCR扩增技术，以pEGFP-C3质粒为模板，扩增SV40和Neo/Kana片段，琼脂糖电泳后切胶回收；然后利用Not1和EcoR1切除片段两端的保护碱基； 

（3）pll3.7质粒经Not1和EcoR1双酶切，切除从3065到4431共1366个碱基对，即CMV和GFP片段，琼脂糖电泳，将大片段切胶后回收； 

（4）利用T4连接酶将上述经Not1和EcoR1双酶切后SV40和Neo/Kana片段与pll3.7的大片段连接，转化大肠杆菌DH5α后，将菌液涂在含有卡那霉素的LB培养平板上，过夜培养； 

（5）挑取单克隆，进行扩大培养；提质粒后进行PCR鉴定和酶切鉴定，结果分别如图1、2，表明构建成功，构建成功的pll3.7-Neo载体的结构如图3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：1。 

本发明慢病毒干扰载体pll3.7-Neo带有Neo筛选标志，并且去除了GFP的基因表达框，其便于对各种蛋白的过表达和敲除同时进行，并且不影响对目的蛋白在细胞中定位的观察，为细胞复杂信号通路的研究提供了新的工具。 

附图说明

图1：PCR鉴定pll3.7-Neo载体构建成功的PCR产物电泳图。图中：M泳道为核酸maker，1泳道以pEGFP-C3载体为模板，2泳道以新构建的pll3.7-Neo载体为模板。 

图2：pll3.7载体双酶切产物电泳图。图中：M泳道为核酸maker，1泳道为pll3.7-Neo载体双酶切产物。2泳道为pll3.7载体双酶切产物。 

图3：构建成功的pll3.7-Neo载体结构图。 

图4：pll3.7-Neo-β-catenin重组载体的菌液PCR产物电泳图。图中M泳道为核酸maker，1泳道以pll3.7-Neo载体为模板作为对照。2-7泳道为pll3.7-Neo-β-catenin-1，8-13泳道为pll3.7-Neo-β-catenin-2，14-19泳道为pll3.7-Neo-β-catenin-3。 

图5：pll3.7-Neo-β-catenin重组载体测序图。图中1为pll3.7-Neo-β-catenin-1的测序结果，图中2为pll3.7-Neo-β-catenin-2的测序结果，图中3为pll3.7-Neo-β-catenin-3的测序结果。 

图6：Western Blot实验检测β-catenin蛋白表达量。