[发明专利]一种脂质代谢型肥胖基因体质评估的方法

权利要求书

1.一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法，其特征在于，具体步骤为 

步骤1：检测的样品类型与采样方法

用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；

步骤2：基因组DNA的抽提方法

采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；

步骤3：荧光定量PCR反应

将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806；脂蛋白脂酶（LPL）rs320；过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282；肾上腺素受体（ADRB3）rs4994，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；

每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan?-MGB技术，进行检测试剂合成；

在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl 的DNA模板2μl 、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ? MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl₂溶液、0.02μl（5units/μl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、4个位点分别采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC荧光探针（10μM，0.25μl）和FAM荧光探针（10μM，0.25μl）工具进行检测（探针、引物、序列如下）；

三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806

带VIC荧光A型探针   CAAaGGAGAAACT

带FAM荧光G型探针   CAAgGGAGAAACT

正向引物   AAGTCTGTGCAATGGATCAAAA

反向引物   CTCACCAGGATTGGCTTCAG

cataaattgc aaaatagtga ggatgttgtt catctaataa aagtggttcc aggaattcag

actctggatt cctgtttgcc aaatcatgtg tcccactctt aagaaaacga gttggactct

ggatttttct ttgcaagagg gacaagagtg tgggagatac tgagttaatg caacttgcag

gttttaagtg tcctgtcatt gtgccttgtg ctttgataca ttctgagttt cagtaaagag

acctgatgca ttggactgtt gcaatggaac ctgttttaag atcttcaaag ctgtattgat

atgaagttct ccaaaagact tcaaggaccc agcttccaat cttcataatc ctcttgtgct

tgtctctctt tgcatgaaat gcttccaggt atttttgcaa ggctaccagt tacatttgac

aagtctgtgc aatggatcaa aatcagaaga gatgattcaa cttggtgacc aagaagtttc

tgagctttgt ggcctaccaa rggagaaact ggctgcagca gagcgagtac ttcgttccaa 

catggacatc ctgaagccaa cctggtgagt agacttgctc actggagaaa cttcaagcac

taatgctttc ggaatgtgag gcttttcctt ggacagcatg actttgtttt gtagaaaagt 

acggctggct gggagtttgt gatataattt agttcagtgg tattctaagt gttcttagtg

ttctttcaga cttttgggcc atctcccaaa gggtgaatgg gaagaataag ctgggtgtgg 

ctgagtttaa gccaaaagtt ttttgtgctt gtttcaatca gagaagacct gctttttcat 

gtttttacta ttataatact aagcaagagc tcatttgaaa acagagttct tcatatttaa 

aaaaaaaaag tcttgaaacc attgatggga agatggatat ctatttatgt ttaaaaaccc 

atcataaaga tgacattgtg ggctgtcaca gttggaaggc

脂蛋白脂酶（LPL）rs320

带VIC荧光G型探针   AGCgTTTATACTA

带FAM荧光T型探针   AGCtTTTATACTA

正向引物   CCACCCATGTGTACCCATAAA

反向引物   TTTGGTGATACAAGCAAATGAC

aggagagact cagaaaaagt aattaaatgt atttttcttc cttcacttta gacccccacc

tgatgtcagg acctaggggc tgtatttcag gggccttcac aattcaggga gagctttagg

aaaccttgta tttattactg tatgatgtag attttcttta ggagtcttct tttattttct

tatttttggg gggcaggggg ggggaagtga cagtattttt gtatttcatg taaggaaaac

ataagccctg aatcgctcac agttattcag tgagagctgg gattagaagt caggaatctc

agcttctcat ttggcactgt ttcttgtaag tacaaaatag ttagggaaca aacctccgag

atgctacctg gataatcaaa gattcaaacc aacctcttca agaagggtga gattccaaga

taatctcaac ctgtctccgc agccccaccc atgtgtaccc ataaaatgaa ttacacagag

atcgctatag gatttaaagc ktttatacta aatgtgctgg gattttgcaa actatagtgt 

gctgttattg ttaatttaaa aaactctaag ttaggattga caaattattt ctctttagtc 

atttgcttgt atcaccaaag aagcaaacaa acaaacaaaa aaaaaaagaa aaagatcttg 

gggatggaaa tgttataaag aatctttttt acactagcaa tgtctagctg aaggcagatg 

ccctaattcc ttaatgcaga tgctaagaga tggcagagtt gatcttttat catctcttgg

tgaaagccca gtaacataag actgctctag gctgtctgca tgcctgtcta tctaaattaa 

ctagcttggt tgctgaacac caggttaggc tctcaaatta ccctctgatt ctgatgtggc 

ctgagtgtga cagttaatta ttgggaatat caaaacaatt acccagcatg atcatgtatt 

atttaaacag tcctgacaga

过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282

带VIC荧光C型探针   GACcCAGAAAGCG

带FAM荧光G型探针   GACgCAGAAAGCG

正向引物   GCAAACCCCTATTCCATGCT

反向引物   TACATAAATGCCCCCACGTC

agctttctgg tatttcataa gcaagagatt taagttttcc atttaagaag caattgtgaa

ttttacaaca ataaaaaatg caagtggata ttgaacagtc tctgctctga taattctaaa

tacagtacag ttcacgcccc tcacaagaca ctgaacatgt gggtcaccgg cgagacagtg

tggcaatatt ttccctgtaa tgtaccaagt cttgccaaag cagtgaacat tatgacacaa

ctttttgtca cagctggctc ctaataggac agtgccagcc aattcaagcc cagtcctttc

tgtgtttatt cccatctctc ccaaatattt ggaaactgat gtcttgactc atgggtgtat

tcacaaattc tgttacttca agtctttttc ttttaacgga ttgatctttt gctagataga

gacaaaatat cagtgtgaat tacagcaaac ccctattcca tgctgttatg ggtgaaactc

tgggagattc tcctattgac scagaaagcg attccttcac tgatacactg tctgcaaaca 

tatcacaagg taaagttcct tccagatacg gctattgggg acgtgggggc atttatgtaa 

gggtaaaatt gctcttgtag ttgtcttcca ggttgtgttt gttttaatac tatcatgtgt 

acactccagt attttaatgc ttagctcgtt gctatcgcgt tcatttaaaa acatgttcag 

aaccttaaaa aaggaaacct aacctaatct attttatctc tgtgcatggc tcccatttcc 

tgaattttaa gcattaaagg tatagttata tccaaaaaca atcctgttca tttttatttc 

ctgagtttgc atagatttcc caagaataca taagggcttt ttagacttga agggtcactt

tttcctcttt tcatctcata tgttagagat ctctcataac tgtttttatc cctcttgcag 

cacttttatt cctcttgaag tactctcagc tcttttctgt

肾上腺素受体（ADRB3）rs4994 

带VIC荧光C型探针   GCCcGGACTCCGA

带FAM荧光T型探针  GCCtGGACTCCGA

正向引物   ATCCAGTACCCCTTGGTTCC

反向引物   GTTTCCCTGAGGCTGTCTTG

ttcctccaga tttagctaaa ggaaacgtgg agcatcccat tggccatcct ccccactctc

caattcggct ccagaggccc ctccagacta taggcagctg cccctttaag cgtcgctact

cctcccccaa gagcggtggc accgagggag ttggggtggg gggaggctga gcgctctggc

tgggacagct agagaagatg gcccaggctg gggaagtcgc tctcatgcct tgctgtcccc

tcccctgagc caggtgattt gggagacccc ctccttcctt ctttccctac cgccccacgc

gcgacccggg gatggctccg tggcctcacg agaacagctc tcttgcccca tggccggacc

tccccaccct ggcgcccaat accgccaaca ccagtgggct gccaggggtt ccgtgggagg

cggccctagc cggggccctg ctggcgctgg cggtgctggc caccgtggga ggcaacctgc

tggtcatcgt ggccatcgcc yggactccga gactccagac catgaccaac gtgttcgtga 

cttcgctggc cgcagccgac ctggtgatgg gactcctggt ggtgccgccg gcggccacct 

tggcgctgac tggccactgg cgttgggcgc cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga 

cgtgctgtgt gtgaccgcca gcatcgaaac cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct 

ggctgtgacc aacccgctgc gttacggcgc actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc 

tgtggtcctg gtgtgggtcg tgtcggccgc ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg 

gtggcgcgta ggggccgacg ccgaggcgca gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc 

cttcgcctcc aacatgccct acgtgctgct gtcctcctcc gtctccttct accttcctct 

tctcgtgatg ctcttcgtct acgcgcgggt tttcgtggtg

将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806；脂蛋白脂酶（LPL）rs320；过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282；肾上腺素受体（ADRB3）rs4994四张图;

步骤4：SNP基因型分析

将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；

（1）、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806

在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型， 

（2）、脂蛋白脂酶（LPL）rs320

在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型， 

（3）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282

在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴中间区域为CG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型， 

（4）、肾上腺素受体（ADRB3）rs4994

在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型。

2.权利要求书1中的所述的四个基因的组合模式。